外源基因表達(dá)以及其優(yōu)化策略

1、外源基因的表達(dá)及其優(yōu)化策略第一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月本章重點(diǎn)掌握內(nèi)容基因表達(dá)的關(guān)鍵要素及要求影響外源基因表達(dá)的因素表達(dá)產(chǎn)物的純化甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)第二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素基因表達(dá)： 從DNA分子有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子和反密碼子系統(tǒng)，轉(zhuǎn)變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑?gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子過程，從而決定生物有機(jī)體遺傳表型。第三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。 基因工程中，基因高效表達(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段

2、，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。第四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月基因表達(dá) 遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程。中心法則central dogma第五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月克隆基因的表達(dá) 外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá) 外源基因 表達(dá)載體 重組載體 導(dǎo)入宿主細(xì)胞 在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì) 提取蛋白 宿主細(xì)胞： 原核細(xì)胞或真核細(xì)胞第六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、影響外源基因表達(dá)的因素主要有： 閱讀框架 順式作用元件 翻譯過程 表達(dá)體系第七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （一）閱讀框架

3、(open reading frame)對(duì)外源基因表達(dá)的影響 （二）順式作用元件(cis-acting element)對(duì)基因表達(dá)的影響 順式作用元件是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點(diǎn)，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子 1.對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控 2.對(duì)基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控 3.對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響 第八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）順式作用元件(cis-acting element)對(duì)基因表達(dá)的影響 1.對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控 1)啟動(dòng)子 ：RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件 TATA box GC box CAAT Box 提高轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確性與頻率 2)增強(qiáng)子：遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（上游或下游

4、）、決定組織特異性表達(dá)、增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的特異DNA序列 3)沉默子：負(fù)調(diào)節(jié)元件，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用第九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （二）順式作用元件對(duì)基因表達(dá)的影響 2.對(duì)基因轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控 1)終止子 ：給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列 2)衰減子：操縱子的前導(dǎo)區(qū)(操縱子內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄到結(jié)構(gòu)基因編碼開始位置之間的一段DNA)內(nèi)類似于終止子結(jié)構(gòu)的一段DNA序列 3.對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響 1)核基質(zhì)結(jié)合區(qū) ：造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性 2)絕緣子 ：阻止臨近調(diào)控元件，對(duì)所界定基因的啟動(dòng)子起增強(qiáng)或者阻遏的作用 3)基因座控制區(qū)：以組織特異性及拷貝數(shù)

5、依賴的方式將相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)到生理學(xué)水平的異位染色質(zhì)位點(diǎn)第十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （三）翻譯過程對(duì)表達(dá)的影響 1.翻譯起始對(duì)基因表達(dá)的影響 2.密碼子偏愛性對(duì)基因表達(dá)的影響 3.翻譯終止對(duì)基因表達(dá)的影響 （四）表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響第十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成。宿主細(xì)胞分為兩大類：第一類為原核細(xì)胞： 大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細(xì)胞： 酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。 目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母，已建立了許多適合它們

6、的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法。許多外源基因已獲得成功表達(dá)。第十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月用原核生物作宿主。 A dividing E. coli 原核或噬菌體啟動(dòng)子 MCS SD序列 終止子 第十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì) 全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì) 缺

7、乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白真核與原核生物結(jié)構(gòu)上存在差別第十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一、原核生物細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn) 1.原核生物只有一種RNA聚合酶識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。 Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。第十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一、原核生物細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn) 3.原核生物的轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。 4.原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。 5.原核生物基因

8、的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對(duì)基因產(chǎn)物直接控制要慢。第十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行第十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一、原核生物細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn) 6.在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個(gè)翻譯起始密碼子及同16S RNA 3末端堿基互補(bǔ)的序列，即SD序列。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一個(gè)啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3末端堿基互補(bǔ)的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。 第十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月二、外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)具備條件 1.通

9、過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶⒅笇?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。 2.外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA。 3.必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)。 4.外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(ORF)。 5.利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害。 第二十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 原核生物基因表達(dá)載體的組成特征 啟動(dòng)子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列) 終止子 選擇標(biāo)記基因 復(fù)制子 原核生物基因表達(dá)的受體系統(tǒng) 大腸桿菌受體系統(tǒng)、芽孢桿

10、菌受體系統(tǒng) 鏈霉菌受體系統(tǒng)、藍(lán)藻受體系統(tǒng)第二十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分第二十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動(dòng)子 是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。 （1）啟動(dòng)子序列 大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。 -35 Box 和 -10 Box 第二十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月不同啟動(dòng)子的consensus sequences 第二十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控

11、 1. 啟動(dòng)子 （1）啟動(dòng)子序列 -35box：RNA聚合酶 亞基的識(shí)別位點(diǎn) 。 5-TTGACA-3 -10box（Pribnow Box）：5-TATAAT-3 TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 17bp 5 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 第二十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月原核啟動(dòng)子共有序列的功能 三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動(dòng)子 （1）啟動(dòng)子序列第二十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 1. 啟動(dòng)子 （2）翻譯的起始位點(diǎn) a)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ ribosome binding site ,RBS） Shine-Dalgarno

12、（SD） sequence： mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。 S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯 b)起始密碼：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）第二十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 2.RNA多聚酶 大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。 第二十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子 在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子。 啟動(dòng)子 操縱區(qū)S-D序列 目的基因 終止子 第二十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于20

13、22年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子 原理： 莖環(huán)結(jié)構(gòu) 反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對(duì)的堿基數(shù)降低，整個(gè)減弱了RNA 與DNA的互作 多聚A/U 由于莖環(huán)3段緊接一串A/U的配對(duì)，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。 第三十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子第三十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 3. 轉(zhuǎn)錄終止子第三十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控 4. 翻譯終止密碼 大腸桿菌偏愛UAAU

14、。一般安置上全部的三個(gè)終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。 5. 翻譯增強(qiáng)子（Translation enhancer） 能夠顯著增強(qiáng)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。 T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡(jiǎn)稱g10-L序列）; 大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段第三十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體1. 非融合型表達(dá)載體載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列 ATG-外源基因-TAG 優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 缺點(diǎn)：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第三十四張，PPT共一百三十

15、三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體： 結(jié)構(gòu)組成： 1）強(qiáng)啟動(dòng)子: tac（trp-lac） 2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。 trp的-35區(qū) lacUV5的-10區(qū) lac操縱基因 第三十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體： 結(jié)構(gòu)組成： 3）調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。 如JM105菌。 4）終止子：rrnB的強(qiáng)終止子 S-D序列和插入位點(diǎn)區(qū)：S-D 插入位點(diǎn)區(qū) Lac I 第三十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、

16、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體： 結(jié)構(gòu)組成： 6）載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。 7）表達(dá)誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會(huì)被降解） tac P Lac O S-D 插入位點(diǎn)區(qū) rrnB T 宿主lac I 阻遏物 IPTG 第三十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 1. 非融合型表達(dá)載體 pKK223-3 載體：條件： 必須選擇一個(gè)有l(wèi)acI的宿主菌。第三十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 2. 分泌型表達(dá)載體 載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿

17、主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。 如：pIN III系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, 第三十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 2. 分泌型表達(dá)載體 pIN III系列 組成結(jié)構(gòu) 1）強(qiáng)啟動(dòng)子：Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。 2）調(diào)節(jié)基因：lac I 。3）S-D序列和起始密碼ATG。 4）分泌信號(hào)肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）。 Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位點(diǎn) 第四十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月p

18、IN III-comA1 四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 2. 分泌型表達(dá)載體第四十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) 表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 如：pGEX系列 優(yōu)點(diǎn)：便于融合蛋白的分離和純化。 組成結(jié)構(gòu)： 1）啟動(dòng)子：tac 2）操縱基因：lacP 3）調(diào)節(jié)基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）第四十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) pGEX系列l(wèi)acI tac

19、 lac O S-D/ATG GST 插入位點(diǎn) TGA lacP GST融合蛋白用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化。產(chǎn)物提純:第四十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) pGEX系列 產(chǎn)物分離:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。 第四十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月pGEX-2X的插入?yún)^(qū)pGEX-1X的插入?yún)^(qū)pGEX-3X的插入?yún)^(qū)四、常用大腸桿菌表達(dá)載體 3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) pGEX系列插入?yún)^(qū)第四十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月四、常用大腸桿菌表

20、達(dá)載體 4.其他融合蛋白系統(tǒng) His-tag（組氨酸標(biāo)簽） 在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His）。 His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。第四十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式位于細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞周質(zhì)細(xì)胞外表達(dá)產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白第四十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞質(zhì)中表達(dá): 外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達(dá)時(shí)，常會(huì)發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。 包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。第四

21、十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的合成是在細(xì)胞之中進(jìn)行的 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是： 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單； 能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)胞總 蛋白的20%40%。 目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種： 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中 在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借助于 本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最終分 泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。第四十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月周質(zhì)中表達(dá)： 周質(zhì)：在大腸桿菌一類革蘭氏陰性菌中，位

22、于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。 在周質(zhì)中表達(dá)的蛋白，需要信號(hào)肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)。第五十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月胞外表達(dá)： 使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。途徑： 1. 用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序） 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）第五十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 1.包涵體蛋白 本質(zhì)：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集

23、 包括：1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用； 3.蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點(diǎn)：易于分離純化第五十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。 包涵體基本由蛋白質(zhì)組成，其中大部分是外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有正確的AA序列，但空間構(gòu)想往往是錯(cuò)誤的，因而沒有活性，此外，它還含有受體細(xì)胞本身高效表達(dá)的蛋白產(chǎn)物（如RNA聚合酶、外膜蛋白等），以及質(zhì)粒的編碼蛋白，其第三種組分是D

24、NA、RNA、脂多糖等非蛋白分子。第五十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn) 在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集 簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì) 菌裂解物中分離出來 能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白。第五十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn) 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過 有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象

25、（因而具有生 物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收 率至關(guān)重要。 經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性， 有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys 殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過 30% 復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。第五十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月形成包涵體的原因： 缺少真核生物中翻譯后修飾所需的酶，使中間體大量積累。 缺乏蛋白質(zhì)折疊過程中需要的某些酶和輔因子，或環(huán)境不適無法 形成正確的次級(jí)鍵。 表達(dá)水平（重組異源蛋白過量表達(dá)）。 細(xì)菌的遺傳性狀。 異源蛋白氨基酸序列（含

26、硫氨基酸越多越容易）。第五十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月減少形成包涵體的策略： 降低重組菌的生長溫度 添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑（高濃度多醇類、蔗糖） 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)基（供氧、pH等）第五十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月包涵體的分離： 菌體破碎（高壓勻漿、高速碾磨、低溫反復(fù)凍融等） 離心收集（高速離心） 清洗（去污劑和低濃度變性劑洗滌以除去脂類和膜蛋白）第五十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵。在 人工條件下，使包

27、涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸 促 溶 劑 鹽酸胍、尿素 混 合 溶 劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用， 溶解力增強(qiáng) 極 端 pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)第五十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月包涵體的變性與復(fù)性操作 包涵體的復(fù)性與重折疊 包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)： 將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊 通過次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性第六十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月伸展態(tài)后期中間體中間體聚集體（聚集過程）天然態(tài)（復(fù)性過程）快慢慢 包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性

28、效率取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競(jìng)爭(zhēng)，涉及兩種疏水作用： 分子內(nèi)疏水相互作用，可促進(jìn)正確折疊； 部分折疊肽鏈分子間的疏水相互作用，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。第六十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月一個(gè)有效、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備的特點(diǎn)： 活性蛋白質(zhì)的回收率高 正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)分離 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品 折疊復(fù)性方法易于放大 復(fù)性過程耗時(shí)較少第六十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 2.融合蛋白 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因的閱讀框，這種方式表達(dá)的蛋白. 優(yōu)點(diǎn)：

29、穩(wěn)定性加強(qiáng)；具有較高的水溶性和一定的生物活性；能高效表達(dá)；易于分離純化. 第六十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。其中通常受體細(xì)菌蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。第六十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 融合蛋白質(zhì)配偶體：指融合蛋白質(zhì)中與目標(biāo)蛋白質(zhì)連接的別種蛋白質(zhì)組分。 常見的配偶體：葡萄球菌蛋白質(zhì)A(SPA)、鏈球菌蛋白質(zhì)G(SPG)、谷胱甘

30、肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和硫氧還蛋白(Trx)。第六十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建的三個(gè)原則： 首先，受體細(xì)菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化。 其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定了融合蛋白的裂解方法。 最后，當(dāng)兩個(gè)蛋白編碼序列融合在一起時(shí)，外源基因的表達(dá)取決于其正確的翻譯閱讀框架。 第六十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月生命科學(xué)學(xué)院第六十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2

31、022年6月用融合載體組合表達(dá)融合蛋白質(zhì)： 以Ecoli. lacZ為靶基因的組合最典型，含三個(gè)不同載體，每個(gè)載體都有一個(gè)lacZ啟動(dòng)子和SD序列，且在lacZ基因下游部位具有一EcoR識(shí)別序列 (GAATTC) 5上游存在著不同數(shù)量的G-C堿基對(duì)。三種情況必有一個(gè)保持著正確的讀碼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生出真實(shí)的融合蛋白質(zhì)。第六十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)第六十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)第七十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022

32、年6月大腸桿菌甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因(mtld) 引物引物1：5GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTGGCG 3引入BamHI酶切位點(diǎn)引物2：5TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG3引入SacI酶切位點(diǎn)全長1149bp，382個(gè)氨基酸，45kD第七十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月融合蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)： 第一個(gè)顯著特點(diǎn)是穩(wěn)定性大大增加。 第二個(gè)特點(diǎn)是融合蛋白質(zhì)的多肽片段有可能構(gòu)成信號(hào)肽序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)分配到細(xì)胞的正確部位。 第三個(gè)特點(diǎn)是分離純化簡(jiǎn)單?？筛鶕?jù)受體細(xì)菌蛋白的特異性抗體、配體底物等迅速純化融合蛋白質(zhì)。第七十三張，PP

33、T共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月融合蛋白質(zhì)的純化 基本原理： 利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對(duì)應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出柱外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。第七十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 異源蛋白質(zhì)的回收： 將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種。 化學(xué)斷裂法：最佳試劑為溴化氰，作用于甲硫氨酸側(cè)鏈進(jìn)行硫醚基反應(yīng)，后水解斷裂。 蛋白質(zhì)酶法：每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇。試劑識(shí)別位點(diǎn)酶識(shí)別位點(diǎn)溴化氰Met-XXa因子Ile-Glu-Gly-Arg

34、-X甲酸Asp-Pro凝血酶Gly-Pro-Arg-X羥胺Asn-Gly胰蛋白酶Arg-X枯草蛋白酶Gly-Ala-His-Arg-X第七十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)第七十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 五、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 3. 整合型外源蛋白 外源蛋白的基因序列在宿主細(xì)胞染色體的同源序列的介導(dǎo)下，整合到宿主細(xì)胞的染色體上，進(jìn)行表達(dá)的方式。 4.分泌型外源蛋白 編碼的外源蛋白在某種機(jī)制下分泌到細(xì)胞外的這類蛋白。 優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)化純化處理工藝；減少外源蛋白降解的概率；有利于形成正確地空間構(gòu)想，獲得較好的生物活性

35、或免疫原性第七十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的外泌表達(dá)型 把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解，也有利于分離純化。 目前成功的例子主要是采用以下方案: （1）與大腸桿菌本身的外泌蛋白基因融合表達(dá) （2）與一些能提高細(xì)胞外膜通透性的因子融合或共表達(dá) （3）改變培養(yǎng)基的成分 歸納現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示這些方法僅對(duì)外泌分子量較小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比較低。第七十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 1. 選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac 等 2. 調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離 一般為5-9bp 距

36、離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離 3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子 能提高翻譯的起始效率 4. 增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 第七十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系 （1）誘導(dǎo)表達(dá) 將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開 一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo) PL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型: cI857 PL 外源基因 PO 第八十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 （1）誘導(dǎo)表達(dá) tac啟動(dòng)

37、子是藥物誘導(dǎo)型 調(diào)節(jié)基因lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。 無IPTG 阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。 有IPTG 阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。第八十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月AmpR Plasmid pGEX-KGGSTlacIq Ptac PromoterAmpr IPTG第八十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 （2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制 將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。 當(dāng)宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體制

38、粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。 當(dāng)需要宿主大量生長時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。 第八十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 防止被宿主的酶降解。 （1）設(shè)計(jì)成融合蛋白 這是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。 質(zhì)?；虍a(chǎn)物 目的基因產(chǎn)物 N C 切割 第八十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。 1)使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減

39、少宿主菌的蛋白酶合成。 2)大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 3)T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上。第八十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （3）表達(dá)分泌蛋白細(xì)胞質(zhì) 外膜 內(nèi)膜 周間質(zhì) 質(zhì)粒 染色體 “外排”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “分泌”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第八十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （3）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)菌蛋白分泌的條件： 有信號(hào)肽:位于N

40、端，一般為15-30aa 。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換。 堿性氨基酸 N 疏水氨基酸核心區(qū) 切割位點(diǎn) Arg、Lys Leu、Ile AlaGlySer 信號(hào)肽酶 外源蛋白 第八十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月六、提高外源基因表達(dá)效率的方法 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （3）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)菌蛋白分泌的條件： 蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa 序列:為蛋白指明目的地。 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制:信號(hào)肽酶I、信號(hào)肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。 真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。第八十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于20

41、22年6月七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 1.western blotting 前提是：表達(dá)產(chǎn)物是已知蛋白第八十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 2. HPLC高效液相層析 第九十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 3.聚丙烯酰胺凝膠電泳第九十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 4.等電聚焦電泳第九十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 5.雙向電泳第九十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月七、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 6.免疫電泳 7.放射免疫測(cè)定 8.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 第九

42、十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)的區(qū)別？ 1.原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)是原核細(xì)胞; 真核表達(dá)系統(tǒng)則是在真核細(xì)胞里例如酵母細(xì)胞, 昆蟲細(xì)胞, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。 2.兩種表達(dá)系統(tǒng)都是通過含有原核或者真核啟動(dòng)子以及其他其他表達(dá)相關(guān)元件的質(zhì)粒系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。 3.原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)相比,表達(dá)量效率便于優(yōu)化調(diào)整,表達(dá)量高. 但用來表達(dá)真核來源的外源基因時(shí),由于蛋白折疊和糖鏈修飾不同,因此其應(yīng)用受限. 真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量相對(duì)較低, 雖然酵母和昆蟲系統(tǒng)表達(dá)量相對(duì)較高,但是在表達(dá)哺乳細(xì)胞來源基因同樣存在折疊和糖

43、鏈修飾的不足。 第九十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的特點(diǎn) 1.基因組DNA的存在形式可影響基因表達(dá) 2.轉(zhuǎn)錄與翻譯不偶聯(lián) 3.調(diào)控是多層次的 4.具有組織和細(xì)胞類型特異性 5.對(duì)信號(hào)分子反應(yīng)不同第九十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、真核生物基因表達(dá)載體的組成特征 第九十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、真核生物基因表達(dá)載體的組成特征 1.原核DNA序列 2.啟動(dòng)子 組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子 3.增強(qiáng)子 4.終止子 5.內(nèi)含子 6.polyA加尾信號(hào) 7.選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基

44、因第九十八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、真核表達(dá)的受體系統(tǒng) （一）酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母是一類最簡(jiǎn)單的真核生物,其生長代謝與原核生物相似；但在基因表達(dá)與調(diào)控方面類似于高等生物。 1、酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第九十九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)

45、酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的 基因工程受體系統(tǒng)（GRAS）酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物第一百張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、常用的宿主釀酒酵母宿主菌巴斯德畢赤酵母宿主菌乳酸克努維酵母宿主菌多型漢森酵母宿主菌 其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。 由畢赤酵母表達(dá)應(yīng)用于臨床的蛋白目前有胰島素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多種抗體等。第一百零一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、酵母基因表

46、達(dá)載體 酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建第一百零二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA復(fù)制起始區(qū)（含兩類復(fù)制起始序列）選擇標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標(biāo)記）有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達(dá)盒(啟動(dòng)子、分泌信號(hào)序列、終止子等)第一百零三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母基因表達(dá)載體的種類： YRp類（yeast replication plasmid 自主復(fù)制型質(zhì)粒） YEp類（yeast episomal plasmid 附加體質(zhì)粒） YIp類（yeast integrativ

47、e plasmid 整合型質(zhì)粒） YCp類（yeast centromeric plasmid 著絲粒質(zhì)粒） YAC 酵母人工染色體第一百零四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建： ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個(gè)ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點(diǎn)的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。 以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp 以2質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為Yep 上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻

48、所致。第一百零五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建: 在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第一百零六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建: CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列 將CEN DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱YCp YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1 - 5個(gè)第一百零七張，PPT共一百三十三頁，

49、創(chuàng)作于2022年6月5、酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（1）酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%。第一百零八張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性： 吸收線型DNA的

50、能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍 共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見第一百零九張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法 酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105 /gDNA。第一百一十張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月6、酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇（1）釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 釀酒酵母基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的

51、啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌；且發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙醇。第一百一十一張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng) 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。第一百一十二張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因此有利

52、于擴(kuò)大生產(chǎn)獲得高濃度細(xì)胞，從而進(jìn)行高效表達(dá)2、通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易丟失；且外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達(dá)菌株3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的強(qiáng)啟動(dòng)子特別適用于外源基因的調(diào)控表達(dá)（3）巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)第一百一十三張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離5、畢赤酵母對(duì)外源蛋白產(chǎn)物進(jìn)行N-乙酰糖基化修飾的結(jié)構(gòu)為高甘露糖型，糖鏈平均為814個(gè)甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3連接的甘露糖殘基(

53、有強(qiáng)的免疫原性)，因而適用于臨床應(yīng)用6、使用方便、簡(jiǎn)單，而且成本較低第一百一十四張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月生長迅速乙醇氧化酶基因AOX1所屬強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)的可誘導(dǎo)性 已有百余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第一百一十五張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng) 甲醇酵母的生物學(xué) AOX1 and AOX2 Mut+ and Muts 表達(dá)載體和受體菌 pPIC3.5K（胞內(nèi)表達(dá)） pPIC9.3K（分泌表達(dá)） pAO815 （多拷貝表達(dá)）第一百一十六張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月載體結(jié)構(gòu)上的共同點(diǎn)：5AOX1 重

54、組位點(diǎn)MCS 多克隆位點(diǎn)TT 轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列3AOX1 重組位點(diǎn)His4 重組位點(diǎn) 篩選標(biāo)記Ampr 篩選標(biāo)記第一百一十七張，PPT共一百三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu)5AOX1 啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；-因子信號(hào)肽序列為約89個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因插入提供位點(diǎn)； TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號(hào)； HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志； 3 AOX1 基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M； 抗Amp 基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在E.coli中篩選和復(fù)