基因克隆以及蛋白表達

1、關(guān)于基因克隆及蛋白表達第一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月研究某一目的基因功能一般策略 目的DNA獲得來自三條途徑:1. genome上的特定區(qū)域或序列2. 含有目的DNA的質(zhì)粒3. 從cDNA文庫中擴增單個已知cDNA獲得目的DNA構(gòu)建含目的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌蛋白表達純化轉(zhuǎn)染真核細胞蛋白定位、表達及表型變化第二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第一部分PCR第三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世紀80年代后期由K.Mullis等建立的一種體外酶促擴增特異D

2、NA片斷的技術(shù)。PCR是利用針對目的基因所設(shè)計的一對特異寡核苷酸引物，以目的基因為模板進行的DNA體外合成反應(yīng)。PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強，操作簡便等特點。目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。第四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、PCR實驗原理第五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、PCR實驗原理第六張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、PCR的反應(yīng)體系 1. PCR引物（1） primer 長度：18-30bp 引物短特異性降低 引物長影響產(chǎn)物生成（2） primer 濃度：0.1-1.0 umol/L 濃度過高錯配、引物二聚體增加 濃度過低PCR效率降

3、低第七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、PCR的反應(yīng)體系 2. 緩沖液 KCl、Tris-Cl、MgCl2 ， Mg2+：1.52.0 mM Mg2+ : DNA聚合酶 活性 PCR產(chǎn)量 Mg2+ : PCR反應(yīng)特異性第八張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、PCR的反應(yīng)體系 3. DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 LA DNA聚合酶 Prime STAR (Pyrobest DNA聚合酶 ) Pfu DNA聚合酶第九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Taq DNA po

4、lymerase5533533553 DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的條件下，以dNTP作為底物，沿53方向合成與模板互補的DNA第十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月LA Taq DNA Polymerase1. 53 DNA聚合酶活性；2. 35 DNA外切酶活性。第十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Pyrobest & pfu DNA Polymerase Taq DNA 聚合酶活性 35外切酶活性，可信度極高 PCR產(chǎn)物為平滑末端第十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR的反應(yīng)體系4dNTP: 50-200 umol/L5. 模板DNA（1） 單鏈

5、DNA（2） 雙鏈DNA（3） 濃度：基因組DNA：1ug 質(zhì)粒DNA：10ng第十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、基本操作步驟1.變性(denature):95高溫下,雙螺旋氫鍵斷 裂,雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA2.退火(annealing):兩條引物與模板DNA擴增區(qū) 域的兩端按堿基互補配對結(jié)合.3.延伸(extension):在4種dNTP底物及Mg2+存在 條件下,Taq DNA聚合酶在72下,將單核 苷酸按堿基互補配對原則從引物3端摻 入,使引物沿53方向延伸合成新股DNA第十六張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月四、條件優(yōu)化1.變性: 95變性20-30s,

6、即可使各種DNA完全變性。2.退火:引物與模板退火溫度由引物長度和GC%決定,退火溫度一般應(yīng)比Tm值低4-12 為宜,退火時間一般為20-40s。3.延伸:通常68-75。延伸時間取決于擴增片斷的長度. 可以500bp/30s為基準，根據(jù)目的片斷的長度計算反應(yīng)時間。4.循環(huán)次數(shù)：一般為25-35次。第十七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)液PCR Buffer（Mg2+） 2.5ldNTP混合物（各2.5mM） 4l模板DNA 1l引物1（20uM） 0.5l引物2（20uM） 0.5lTaq DNA polymerase（5U/ul） 0.25lddH2O至 25l第十八張

7、，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)條件 94 5min94 30sec55 30sec 30 Cycles72 1min72 10min 4 forever第十九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、PCR引物的設(shè)計PCR反應(yīng)成功的一個關(guān)鍵條件是正確設(shè)計引物PCR引物設(shè)計目的是在擴增特異性和擴增效率兩個目標上取得平衡.可以利用計算機軟件進行引物設(shè)計,引物設(shè)計軟件會通過每一引物設(shè)計變化的預(yù)定值在兩個目標間取得平衡,找出最佳引物.有時也需根據(jù)實驗的具體要求進行適當(dāng)調(diào)整.第二十張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的基本原則 (一)引物長度在16-30bp范圍內(nèi),

8、以18-24bp為最佳.引物過短,產(chǎn)物特異性降低,每增加一個核苷酸,引物特異性可增加4倍.引物的長度是指與模板DNA序列互補的部分,不包括為后續(xù)克隆而加的酶切位點與額外序列.第二十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的基本原則(二)引物末端1.引物的3末端對于PCR反應(yīng)是關(guān)鍵.2.引物的3末端的第一和第二個堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率,故其影響PCR反應(yīng)的擴增效率及特異性.引物3末端最佳堿基選擇G或C，因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。第二十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的基本原則3. 引物5末端的堿基無嚴格限制當(dāng)引物的長度足夠時, 引物5末端的堿

9、基可不與模板DNA互補而呈游離狀態(tài)?？稍?端加上限制內(nèi)切酶位點,啟動子序列或其他序列等,以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆。第二十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的基本原則4.在一個PCR反應(yīng)中的一對引物之間不應(yīng)存在互補序列,特別是3末端應(yīng)盡量避免互補,以免形成“引物二聚體”造成引物浪費和非特異性的擴增.5.每個引物的內(nèi)部應(yīng)盡量避免形成二級結(jié)構(gòu),特別是引物的末端應(yīng)無回文結(jié)構(gòu).第二十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的基本原則(三)引物的GC含量和Tm值PCR引物G+C堿基的含量應(yīng)保持在45-65%之間，G+C含量一般為40-60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即

10、在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。PCR擴增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5-10度。引物長度小于20bp時, Tm=4(G+C)+2(A+T) 。第二十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的基本原則(四)引物的位置1.引物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴增區(qū)無同源序列，這樣可減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性。2.若以cDNA為模板，則首先應(yīng)盡量使引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)；其次，盡量把引物放在不同的外顯子上，以便使特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。第二十六張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2

11、022年6月引物設(shè)計的基本原則（五)Primer primer 5.0輔助的引物設(shè)計步驟及條件優(yōu)化第二十七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二部分RT-PCR第二十八張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RT-PCR是將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR結(jié)合起來建立的一種PCR技術(shù)。首先進行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，然后進行常規(guī)PCR。第二十九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA合成 Superscript first-strand synthesis system for RT-PCR 是從總RNA或mRNA合成cDNA。RNA量為1ng5ug。第三十張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于20

12、22年6月Reverse Transcriptase553353351.依賴于RNA的 53 DNA聚合酶活性（反轉(zhuǎn)錄活性）；2.依賴于DNA的 53 DNA聚合酶活性。第三十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Reverse TranscriptaseRNADNADNA3.RNase H 活性：特異性識別并分解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈第三十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RT-PCR 第三十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）進行cDNA第一鏈的合成 RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反轉(zhuǎn)錄酶

13、是一種RNA介導(dǎo)的DNA聚合酶。該酶能以RNA或者單鏈DNA做模板由引物起始合成一個互補的DNA鏈。RNase H活性的缺失增強了該酶合成長鏈cDNA的能力。 編碼M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶的基因在重組大腸桿菌中表達，該酶在其RNase H區(qū)域含一點突變，從而使修飾后酶的RNase活性缺失，但反轉(zhuǎn)錄功能不受影響。第三十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）進行cDNA第一鏈的合成 進行PCR前用Rnase H消化。去除與cDNA結(jié)合的RNA，增加PCR敏感性。第一鏈合成過程中RNase H降解模板mRNA，導(dǎo)致全長cDNA合成減少及cDNA第一鏈產(chǎn)量降

14、低。第三十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA第一鏈的合成有三個方法 （1） Random hexamers：是最非特異性引物。通常在特異全長mRNA難以拷貝時應(yīng)用此引物。利用該方法，以全部RNA做模板合成cDNA。在PCR時，PCR引物決定其特異性。第三十六張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA第一鏈的合成有三個方法（2）oligo（dT）：較特異和常見的方法, 其cDNA的合成數(shù)量和復(fù)雜性大大低于random hexamers方法,尤其是進行新的mRNA RT-PCR時,建議用此方法.第三十七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA第一鏈的合成有三個方

15、法(3) Gene-specific primer(GSP):最為特異的方法。 利用鄰近mRNA 3末端的PCR引物進行cDNA第一鏈合成,但是,某些GSP即使以DNA為模板,能擴增出DNA條帶.有時,也不能進行cDNA第一條鏈合成.此時建議用oligo（dT）引物.第三十八張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA第一條鏈合成步驟第三十九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第三部分克隆第四十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA提取純化RT-PCR質(zhì)粒DNAPCR凝膠回收PCR擴增片段目的基因片段T-A克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細

16、胞藍白斑篩選質(zhì)粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達載體外源基因克隆到真核表達載體GST融合蛋白表達轉(zhuǎn)化、活性測定轉(zhuǎn)染真核細胞表達定位得到目的基因片段的T-A克隆第四十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR片段回收利用從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段的試劑盒。試劑盒采用了獨特的凝膠融解系統(tǒng)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，具有高效快速的特點。本試劑盒純化DNA片段純度高，完整性好?？芍苯佑糜谶B接反應(yīng)，PCR擴增。 第四十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月T-A克隆經(jīng)Taq DNA聚合酶擴增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個A。正是基于這一原理

17、，pGEM-T質(zhì)粒經(jīng)EcoR V切成平端后，在開口端加上一個T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由于T-A互補，提高了T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。 第四十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月T-Vector第四十八張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞：限制修飾酶系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（R，M）。它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2）處理后

18、，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞（Competent cells）。第四十九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 進入受體細胞的DNA分子通過復(fù)制，表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant），即帶有異源DNA分子的受體細胞。 第五十張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月T-Vector第五十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 IPTG (異丙基-半乳糖苷）是-半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)物,可使lacZ

19、 阻抑物失活，從而誘導(dǎo)lac操縱子轉(zhuǎn)錄?；谶@個特性,當(dāng)PUC系列載體以lacZ缺欠細胞作為宿主進行轉(zhuǎn)化時, 如果在培養(yǎng)基中加入X-Gal和IPTG,由于-半乳糖苷酶的-互補性,可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色而方便的選擇出基因重組體.第五十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 X-gal: (5-溴-4氫-3-吲哚-D-半乳糖苷) X-gal是E.Coli產(chǎn)生的-半乳糖苷酶的顯色底物。-半乳糖苷酶可將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{色沉淀。第五十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 雙鏈pGEM-T質(zhì)粒，有一個復(fù)制起點，一個氨芐

20、青霉素抗性基因和一個多克隆位點，多克隆位點處于表達LacZ基因產(chǎn)物-半乳糖苷酶的氨基端片段。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因突變的大腸桿菌株（JM109或DH5）時，因為由質(zhì)粒表達的-肽補充了大腸桿菌缺失的-肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。第五十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月進行藍白篩選，對陽性克隆進行擴增 在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長出藍色克隆。如果在多克隆位點內(nèi)插入外源DNA，由于它破壞了-肽的表達，因而在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基，不能長出藍色克隆，這就是所謂的藍白篩選。第五十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒的提取及酶切鑒定第五十六張，PPT共八十六

21、頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第四部分：外源基因的原核表達第五十八張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月外源基因的原核表達 外源基因的表達是研究和探索基因功能、基因表達調(diào)控機制以及編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的重要方法，亦是制備和生產(chǎn)新型蛋白質(zhì)藥物、新型診斷試劑必不可少的手段。外源基因通過在宿主細胞中的表達可大量獲得其產(chǎn)物。 第五十九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、原核表達系統(tǒng)常用的載體及其應(yīng)用 （一）大腸桿菌表達系統(tǒng) （二）大腸桿菌載體的表達方式 第六十張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌表達系統(tǒng) 大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應(yīng)

22、用最廣泛的經(jīng)典表達系統(tǒng)。優(yōu)點：遺傳背景清晰、目的基因表達水平高、培養(yǎng)周期短等；第六十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌表達系統(tǒng) 缺點：缺少真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工過程，如剪切、糖基化及正確二硫鍵的形成等；表達的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在，需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性；宿主本身雜蛋白多，純化步驟復(fù)雜。第六十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌載體的表達方式 1非融合性表達載體：此種載體表達的蛋白質(zhì)與天然狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。第六十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌載體的表達方式 2融合表達載體：分子量較

23、小的蛋白質(zhì)可采用這種載體進行表達。優(yōu)點：可增加mRNA和表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性；可應(yīng)用針對融合蛋白中非目的蛋白片段進行親和層析，很容易將融合蛋白純化；通過融合表達可產(chǎn)生可溶性蛋白；第六十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌載體的表達方式 融合表達載體主要有以下幾種：谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）系統(tǒng)；-半乳糖苷酶系統(tǒng)；麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）系統(tǒng)；蛋白A系統(tǒng)；與純化標簽融合表達以及其他融合系統(tǒng)。第六十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌載體的表達方式 3帶純化標簽的表達載體：目前應(yīng)用較多的純化標簽有GST-tag, FLAG-tag, His-tag.4分泌型表達載體

24、5表面展示表達載體6帶分子伴侶的表達載體第六十六張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月外源基因的原核表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化第六十七張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月擴增陽性克隆并進行誘導(dǎo)表達 pGEX-5x-1載體帶有IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)啟動子，可以表達外源蛋白的總量可以達到全菌蛋白的30%以上。 第六十八張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月SDS電泳 將含有目標蛋白的樣品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離。利用濃縮膠和分離膠的濃縮效應(yīng)，電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)對不同分子量大小的蛋白質(zhì)進行分離。 第六十九張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十張，

25、PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Western BlotGST-Pro-BGST第七十一張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA提取純化RT-PCR質(zhì)粒DNAPCR凝膠回收PCR擴增片段目的基因片段T-A克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞藍白斑篩選質(zhì)粒提取、酶切鑒定連入GST融合表達載體外源基因克隆到真核表達載體GST融合蛋白表達轉(zhuǎn)化、活性測定轉(zhuǎn)染真核細胞表達定位得到目的基因片段的T-A克隆第七十二張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Northern印跡雜交是用于檢測和量化細胞RNA的一種基本技術(shù)。它主要是將電泳凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，通過紫外交聯(lián)作用而使RNA與膜永久的結(jié)合在一起，

26、固定在膜上的RNA樣品與特異的探針雜交，從而對感興趣的RNA進行定位。 Northern印跡雜交 第七十三張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Northern印跡雜交 一、DNA探針標記 在核酸分子雜交中，探針是指用放射性核素或其他標記物標記的核酸片段，它具有特定的序列，能夠和待測的核酸片段互補結(jié)合，因此可用于檢測核酸樣品中的特定基因。第七十四張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Northern印跡雜交 一、DNA探針標記 用于探針標記的標記物有放射性核素與非放射性核素兩大類，前者是目前最常用的標記方式；后者包括生物素、地高辛及熒光素等。第七十五張，PPT共八十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Northern印跡雜交 一、DNA探針標記核酸探針的標記方法：1.切口平移法2.隨機引物法 這是近年來發(fā)