多糖的提取純化及分析鑒定方法研究(共5頁(yè))

1、多糖的提取純化及分析(fnx)鑒定方法研究王霄(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品(shpn)工程學(xué)院(xuyun)，安徽 合肥 230009)摘 要：詳細(xì)介紹了動(dòng)植物多糖的常見(jiàn)提取純化方法的最新研究進(jìn)展，并比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在提取時(shí)應(yīng)根據(jù)所選材料的性質(zhì)選用不同的方法，有些方法在一定的條件下可與別的方法協(xié)同作用，并對(duì)糖的含量測(cè)定及分析鑒定方法的研究進(jìn)展作了概述。關(guān)鍵詞：多糖；提取；純化；分析鑒定；研究進(jìn)展中圖分類(lèi)號(hào)：TU 411.01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A Progress of Polysaccharides Extraction, Purification and Iden

2、tification MethodsWANG Xiao(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plant polysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each m

3、othed. Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions. In addition, analysis and identification of polysaccharides are out

4、lined. Key words: polysaccharides; extraction; purification; analysis and identification; research progress0 多糖概述多糖（polysaccharide）是由 HYPERLINK /view/604301.htm 糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過(guò)10個(gè)以上的 HYPERLINK /view/43572.htm 單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的單糖組成的多糖稱(chēng)為多糖，如 HYPERLINK /view/42594.htm 淀粉、纖維素和 HYPERLINK /view/455401.

5、htm 糖原；以沒(méi)的單糖組成的多糖稱(chēng)為 HYPERLINK /view/1115682.htm 雜多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和 HYPERLINK /view/571129.htm 半乳糖等組成。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。 HYPERLINK /view/728282.htm 多糖類(lèi)一般不溶于水，無(wú)甜味，不能形成結(jié)晶，無(wú)還原性和 HYPERLINK /view/303784.htm 變旋現(xiàn)象。多糖也是糖苷，所以可以 HYPERLINK /view/19501.htm 水解，在水解過(guò)程中，往往產(chǎn)生一系列的中間產(chǎn)物，最終完全水解得到單糖。近年來(lái)，國(guó)際上對(duì)糖及糖復(fù)合物

6、的研究己成熱點(diǎn)，糖類(lèi)結(jié)構(gòu)測(cè)定和生物活性研究取得了明顯的進(jìn)展。大量實(shí)驗(yàn)事實(shí)揭示糖類(lèi)是重要信息分子，參與許多生理和病理過(guò)程1-2。到目前為止。己有300余種多糖類(lèi)化合物從天然產(chǎn)物中被分離出來(lái)，其中從中草藥、食藥用菌中提取的水溶性多糖最為重要。已發(fā)現(xiàn)有100多種中草藥、食藥用菌來(lái)源的糖綴合物具有廣泛的藥理及生物活性3。在對(duì)各種中藥材化學(xué)成分研究的過(guò)程中，人們逐步提高了對(duì)植物多糖的關(guān)注。植物多糖研究比較深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、銀杏葉多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品領(lǐng)域已經(jīng)取得很好的應(yīng)用。多糖作為重要的生物活性物質(zhì)具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，在

7、醫(yī)療保健、食品、動(dòng)物養(yǎng)殖等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景4-7。1 多糖的提取(tq)工藝1.1 水提醇沉法 水提醇沉法是提取(tq)多糖最常用的一種方法。 多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。 用水作溶劑來(lái)提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水(lngshu)浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來(lái)，室溫靜置5 h，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。影響多糖提取率的因素有：提取溫度、浸提料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。為此，研究者對(duì)影響多糖提取工藝的這些因素進(jìn)行了大量研究。林娟8等研究表

8、明水提法提取甘薯多糖的優(yōu)化工藝條件為：提取溫度85，加水比1：7，提取時(shí)間2.5h，提取率為2671。劉永9等研究表明：最佳提取條件為95，料液比1：20(g：mL)，提取時(shí)間2h，提取3次，茶葉多糖含量為35.92 mg/g。水提醇沉法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類(lèi)等水溶性的成分浸提出來(lái)，從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來(lái)困難，且該法提取比較耗時(shí)，提取率也不高10。1.2 酶法提取 酶技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件下分解植物組織，加速

9、有效成分的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物。此法可使后續(xù)的濃縮和脫蛋白工藝更簡(jiǎn)易、省時(shí)，粗多糖的純度更高。但會(huì)提高生產(chǎn)成本，對(duì)提取條件要求較高。楊云11等人采用的單酶法和復(fù)合酶法提取大棗多糖，單酶法提取多糖含量最高可達(dá)44.69，而復(fù)合酶法多糖最高含量可達(dá)68.13。1.3 超聲波提取 超聲法是利用超聲波對(duì)細(xì)胞組織的破碎作用來(lái)提高多糖浸出率的，具有快速、安全、簡(jiǎn)便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)提取設(shè)備要求較高。李進(jìn)偉12等通過(guò)響應(yīng)面分析法考察超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)棗多糖得率與純度的影響，得出棗多糖最佳的提取工藝條件為：

10、超聲波功率8696W，提取溫度4553，提取時(shí)間20min，料液比1:20（g:ml），棗多糖得率7.63%，純度35.57%。與傳統(tǒng)的水浴浸提法相比，該方法不僅縮短了提取時(shí)間，且提高了棗多糖得率與純度。1.4 微波提取 微波萃取是高頻電磁波穿透萃取媒質(zhì)，到達(dá)被萃取物料的內(nèi)部，能迅速轉(zhuǎn)化為熱能使細(xì)胞內(nèi)部溫度快速上升，細(xì)胞內(nèi)部壓力超過(guò)細(xì)胞壁承受力，細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分流出，在較低的溫度下溶解于萃取媒質(zhì)，通過(guò)進(jìn)一步過(guò)濾和分離，獲得萃取物料。趙怡紅13等研究表明北冬蟲(chóng)夏草多糖微波提取最佳條件：微波功率550W、固液比l：30、提取時(shí)間30s、提取1次，多糖收率3.67。劉青梅14等研究結(jié)果表明:

11、對(duì)于紫菜多糖提取微波提取優(yōu)于熱水提取,微波凍融提取效果最佳,提取率最高達(dá)7.45%,而熱水提取率為2.05%.影響微波浸提的主要因素為浸提時(shí)間,其次是微波功率和液固質(zhì)量比。優(yōu)選方案為微波功率200W、提取時(shí)間8 min、水與紫菜液固質(zhì)量比40:1。1.5 超臨界流體提取 超臨界流體提取法根據(jù)某些氣體在超臨界狀態(tài)下具有特殊的液相性質(zhì)，對(duì)一些組分有較好的溶解性，用來(lái)提取目的產(chǎn)物。一般采用CO2超臨界萃取多糖組分。朱俊玲15通過(guò)超臨界CO2流體萃取處理蘆薈多糖，多糖得率為85.1，是傳統(tǒng)方法的1.5倍。超臨界萃取的最佳工藝條件是乙醇用量為250 ml/100g蘆薈、萃取壓力為25 MPa、萃取溫度為

12、35。1.6 超濾法 超濾是一種膜分離技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用于多糖的提取，具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單、可連續(xù)生產(chǎn)、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)16。1.7 酸提法 有些多糖適合用稀酸提取，并且能夠得到更高的提取率。如趙宇等17對(duì)海蒿子多糖的提取方法研究發(fā)現(xiàn)，從多糖提取得率來(lái)看，酸提法優(yōu)于傳統(tǒng)的水提法。不過(guò)此方法只在一些特定的植物多糖提取中占優(yōu)勢(shì)，目前報(bào)道的并不多。不過(guò)在操作上還是應(yīng)該嚴(yán)格控制酸度，因?yàn)樵谒嵝詶l件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。1.8 堿提法 與酸提法類(lèi)似，有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。不過(guò)，也應(yīng)控制堿的濃度，因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)也會(huì)發(fā)生水解。2

13、 多糖純化(chn hu)方法2.1 除蛋白(dnbi) 根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性(binxng)的特點(diǎn)，用V（氯仿）V（戊醇或正丁醇）為51 或41，混合物劇烈振搖2030 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此種只能除去少量蛋白質(zhì)，效率不高，須反復(fù)多次，多糖有損失。 但此方法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，用Sevage 法效果更佳。李婉婷18研究結(jié)果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除去款冬花多糖中的蛋白最為理想，該法的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶的酶底比為l，pH值7.0，先在50水浴中酶解2h，再經(jīng)Sevage法

14、脫蛋白3次，其蛋白脫除率為88.95，多糖保留率為92.63。 2.2 透析法 透析法是利用一定孔目的膜，使無(wú)機(jī)鹽或小分子糖透過(guò)，而將大分子的多糖截留下來(lái)從而達(dá)到純化多糖的目的。此法的關(guān)鍵是要選擇孔目合適的透析膜。纖維膜孔徑為23nm，可使單糖分子通過(guò)，分離效果較好，透析時(shí)常需要多次換水，溶液的pH值維持在6.06.5范圍內(nèi)。2.3 凝膠柱層析法 凝膠柱層析法主要是根據(jù)多糖分子的大小和形狀不同而達(dá)到分離目的。但溶液流經(jīng)多孔性凝膠柱時(shí)，小分子已擴(kuò)散人孔中，各溶質(zhì)依分子量大小順序依次流出。此方法快速、簡(jiǎn)單、條件溫和。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sephamse)，以不同

15、濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑。此法還可進(jìn)行多糖相對(duì)分子量的測(cè)定。王赫19采用Sephadex G-100凝膠色譜柱分離純化，從龍膽水溶性多糖中分離純化得到2 種不同的均一多糖組分TP-1、TP-2。2.4 纖維素住層析法 纖維素陰離子交換劑柱層析對(duì)多糖的分離是利用pH 6時(shí)，酸性多糖能吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，用pH相同離子強(qiáng)度不同的緩沖液將酸性強(qiáng)弱不同的酸性多糖分別洗脫出來(lái)。常用的陰離子交換纖維素有DEAE-纖維素和ECTEOLA纖維素。張?zhí)m杰20等就采用DEAE-纖維素柱分離北五味子多糖，分別得到了白色結(jié)晶和黃色粉末兩種多糖產(chǎn)物。3 多糖的分析3.1 含量的測(cè)定測(cè)定方法：硫酸-苯

16、酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe 21法、薄層色譜法、酶法、原子吸收法22、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法連、續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)法23、次亞碘酸鹽定量法、蒽酮-硫酸法（總糖）、DNS法24（還原法）、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種方法只對(duì)某些多糖的測(cè)量效果好。比色法分光光度法離子交換色譜法酶法和電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。3.2 純度鑒定多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說(shuō)的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HPLC法等?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的是HPLC法，旋光度

17、測(cè)定25也是純度測(cè)定的一種方法。3.3 分子量的測(cè)定多糖分子量的測(cè)定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過(guò)率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法26。4 多糖的鑒定4.1 多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類(lèi)型、數(shù)目連接方式及苷建構(gòu)型。常用化學(xué)法和儀器分析法。多糖組分與分子比例測(cè)定法：部分酸解法、完全酶解法、色譜法；吡喃、呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵順序水解、核磁共振； -異頭異構(gòu)體：糖苷酶水解核磁共振；羥基被取代情況：甲基化反應(yīng)、

18、氣相色譜、過(guò)碘酸氧化、Smith降解法和測(cè)硫酸基法（terho法）、核磁共振、質(zhì)譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：?jiǎn)翁桥c氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應(yīng)；多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多，迄今沒(méi)有一種方法可以單獨(dú)完成多糖結(jié)構(gòu)的分析。儀器分析與化學(xué)方法相結(jié)合是常用的多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定方法。4.2 多糖高級(jí)(goj)結(jié)構(gòu)測(cè)定目前研究多糖(du tn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)(jsh)，如2D-NMR，13C譜，通用的方法是將現(xiàn)代NMR技術(shù)與理論計(jì)算相結(jié)合通過(guò)一定的理論計(jì)算篩選構(gòu)象，主要的理論計(jì)算方法有從頭計(jì)算、豐度經(jīng)驗(yàn)計(jì)算及經(jīng)驗(yàn)力場(chǎng)計(jì)算27。圓二色譜法（CD）也可用于糖的構(gòu)象分析,張麗萍等28應(yīng)用譜測(cè)定了金頂側(cè)耳

19、多鍺的水溶液構(gòu)象 近年來(lái)，以精確三維結(jié)構(gòu)知識(shí)為基礎(chǔ)揭示重要生命活動(dòng)的規(guī)律已達(dá)到前所未有的深度和廣度29，多糖作為一類(lèi)重要的生物活性大分子其結(jié)構(gòu)的研究勢(shì)必推動(dòng)對(duì)多糖的認(rèn)識(shí)向深層次發(fā)展。5 多糖的應(yīng)用展望我國(guó)對(duì)多糖的研究起步較晚，但近年來(lái)的工作取得了較大的進(jìn)展，愈來(lái)愈多的多糖被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)它們具有復(fù)雜廣泛的生物活性和功能。隨著對(duì)多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性機(jī)理，功效因子會(huì)更加明確，它的應(yīng)用領(lǐng)域也將會(huì)更加拓寬。然而，由于多糖本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，種類(lèi)繁多，其結(jié)構(gòu)測(cè)定和分離純化有很大的難度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分離及多糖的藥理作用與諸多因素有關(guān)，給多糖的研究和應(yīng)用帶來(lái)許多的挑戰(zhàn)，這需

20、要相關(guān)行業(yè)的人士共同應(yīng)對(duì)。參考文獻(xiàn)1 Benzie, I., and Strain, J. The Ferric Reducing Ability of Plasma(FRAP) as a Measure of Antioxidant Power. Analytical Biochemistry. 1996. 239:7076.2 Wang, C., Sun, Z. Earthworm polysaccharide and its antibacterial function on plant-pathogen microbes in vitro. European Journal of So

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26、accharides from rapeseed by ultrafiltration: Effect of molecular pore size and operation conditions on the membrane performance. Separation and Purification Technology, 2011,80:670-676.17 趙宇, 李志富, 任少紅, 等. 海蒿子多糖的提取方法研究J. 泰山 醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 25(5): 429-430.18 李婉婷. 款冬花多糖提取及分離純化研究D. 西安: 西北大學(xué)碩 士學(xué)位論文, 2010.19 王赫. 龍膽多糖的提取純化及其組成糖分析J. 中國(guó)醫(yī)藥指南， 2011, 9(21): 250-251.20 張?zhí)m杰, 張維華, 趙珊紅. 北五味子果實(shí)中多糖的提取純與化研究 J. 鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 4(1): 94-96.21 李 鋒, 唐鳳翔, 林海英, 等. 耳突麒麟菜多糖的提取分離及表征 J. 福州大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 31(1): 106-110.22 武 云, 張 馳. 富硒黑木耳中硒多糖提取分離工