經(jīng)Hutat2Fc基因修飾的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞抗HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知紊亂的實驗研究

1、經(jīng)Hutat2:Fc基因修飾的人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞抗HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知紊亂的實驗研究研究背景和目的:HIV-1反式激活因子Tat對HIV的復(fù)制至關(guān)重要,也是導(dǎo)致HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能紊亂(HIV-associatedneurocognitivedisorder,HAND)的重要神經(jīng)毒性因子?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療不能有效抑制腦內(nèi)HIV的復(fù)制,且不能阻止病毒早期蛋白尤其是Tat的產(chǎn)生,尚不能徹底治愈HAND。HIV感染一旦建立,腦內(nèi)的HIV感染的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞可不斷釋放Tat至細(xì)胞外,由此產(chǎn)生直接和間接的神經(jīng)毒性。因此,設(shè)法在腦內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的抗Tat抗體將可中和Tat,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本研究將構(gòu)建人

2、源化抗Tat單鏈抗體-Fc融合蛋白Hutat2:Fc,通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至人單核細(xì)胞系、神經(jīng)細(xì)胞系和原代人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(humanmonocyte-derivedmacrophages,hMDM),觀察其在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況,并評價Hutat2:Fc融合蛋白的生理學(xué)功能及潛在的副作用。單核/巨噬細(xì)胞可自由的通過血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB),是較為理想的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物或基因遞送載體,以此為載體的治療方法的建立需要很好的了解體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞在炎癥情況下經(jīng)外周循環(huán)向腦內(nèi)遷徙效率。故本研究還將對大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)

3、的腦炎情況下小鼠骨髓源性單核細(xì)胞(bonemarrowderivedmonocytes,bmdm)向腦內(nèi)遷徙的規(guī)律和特點進(jìn)行初步觀察。方法:將構(gòu)建的融合了人igg1引導(dǎo)序列、人源化抗-tat單鏈抗體hutat2、人igg3fc段的重組基因片段(hutat2:fc)連入tat基因敲除的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒骨架phr-hb7-ires-egfp,與pcmv-Ar8.2、pcmv-vsv-g共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞制備重組慢病毒載體hr-hutat2用重組慢病毒載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)人神經(jīng)細(xì)胞系htb-11、單核細(xì)胞系u937和hmdm,通過免疫熒光染色、qrt-pcr、westernblot法和elisa檢測細(xì)胞重組融合蛋白

4、hutat2:fc的表達(dá)和分泌。通過免疫斑點結(jié)合實驗和westernblot法體外檢測hutat2:fc與tat的結(jié)合作用,通過細(xì)胞活力和細(xì)胞相對存活率檢測評價hutat2:fc對tat誘導(dǎo)的htb-11和原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元毒性的保護(hù)作用,通過p24定量來評價hutat2:fc對hiv-1感染的hmdnm勺病毒抑制作用。通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長動力學(xué)、qrt-pcr對15個hmdnStj能相關(guān)基因表達(dá)的檢測，及對hmdm泌的ill屋il8、il10和tnf-a的檢測來評價慢病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在的副作用。用lps小鼠腦炎模型評價經(jīng)鼠尾靜脈輸注的超順磁性氧化鐵(superparamagnetici

5、ronoxide,spio)標(biāo)記的外源性/八鼠bmdmf口gfp轉(zhuǎn)基因小鼠bmdmt中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷徙的特點和分布規(guī)律。結(jié)果：慢病毒載體可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗細(xì)胞系和hmdm(專導(dǎo)效率分別為99%,95%和53%)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可長期、穩(wěn)定的表達(dá)目的蛋白。在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中均可檢測到正確形式的hutat2:fc融合蛋白,hutat2:fc融合蛋白可在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中累積至高濃度。hutat2:fc可體外結(jié)合hiv-1tat,拮抗tat對htb-11細(xì)胞系和原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的毒性作用。分泌的hutat2:fc和hr-hutat2轉(zhuǎn)導(dǎo)的hmdmT顯著抑制hiv-1bal感染的人巨噬細(xì)胞p24的表達(dá)及

6、hiv-1誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)。慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力無顯著影響。15個檢測基因中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的hmdm勺il8、statl和idol基因表達(dá)上調(diào)，但并未觀察到這些基因表達(dá)上調(diào)對hutat2:fc的神經(jīng)保護(hù)作用的影響。體外培養(yǎng)的小鼠bmdnffl胞可遷徙入lps誘導(dǎo)的腦炎小鼠患側(cè)大腦，在移植后第2天數(shù)目達(dá)到高峰，隨后逐漸聚集在炎性部位周圍,進(jìn)入腦內(nèi)的單核細(xì)胞數(shù)目隨腦內(nèi)炎癥的消散而逐漸減少。結(jié)論:慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可有效的將目的基因?qū)肴思?xì)胞系和hmdmj1不引起hmdni!)!顯的免疫激活。受試人類細(xì)胞系和原代hmdntt達(dá)的hutat2:fc融合蛋白具有與完全tat單克隆抗體相似的神經(jīng)保護(hù)和抑制hiv復(fù)