多功能酶標(biāo)儀(共50張)課件

1、酶標(biāo)儀的使用第一頁(yè)，共50頁(yè)。主要內(nèi)容一、ELISA法介紹二、酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀三、儀器操作第二頁(yè)，共50頁(yè)。一、ELISA法介紹經(jīng)典的化學(xué)分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能對(duì)化學(xué)體系組分進(jìn)行常量或微量分析，而對(duì)復(fù)雜生物體系的微量成分的測(cè)定往往力不從心。在此背景下，科學(xué)家研發(fā)了一系列測(cè)定生物體系成分含量的方法，其中免疫化學(xué)法（如酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法、放射免疫法）因具有高特異性、超微量分析生物體有機(jī)成分的特點(diǎn)而得到迅速推廣和發(fā)展。第三頁(yè)，共50頁(yè)。1971年人們建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，并進(jìn)行定量，這種技術(shù)被稱(chēng)

2、為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA。（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay）酶聯(lián)免疫法的專(zhuān)用儀器就是酶標(biāo)儀。第四頁(yè)，共50頁(yè)。分析原理酶標(biāo)儀的分析原理與分光光度法一樣，服從朗伯比爾定律。物質(zhì)的含量與顯色液的顏色深淺成正比，而顏色深淺可用吸光度表示，所以物質(zhì)的含量與吸光度值成正比。酶標(biāo)記抗原或者抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)后，與底物的結(jié)合物，在特定波長(zhǎng)下有最大吸收，可通過(guò)測(cè)定顯色液的吸光度對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量。第五頁(yè)，共50頁(yè)。ELISA法知識(shí)1.免疫學(xué)知識(shí)2.常用的ELISA分析3.ELISA 應(yīng)用第六頁(yè)，共50頁(yè)。1.免疫學(xué)知識(shí)什么是抗體？什么是抗原？什么是抗原抗體反應(yīng)？

3、第七頁(yè)，共50頁(yè)。什么是抗體(Antibody)？ 抗體是機(jī)體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱(chēng)免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。 人類(lèi)免疫球蛋白有五類(lèi)，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 含有免疫球蛋白的血清稱(chēng)免疫血清。第八頁(yè)，共50頁(yè)。免疫球蛋白（Ig） 免疫球蛋白（Ig）是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物?？梢宰钄嗖≡w對(duì)機(jī)體的危害，也可以引起過(guò)敏反應(yīng)或其他有害反應(yīng)。第九頁(yè)，共50頁(yè)。 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)免疫球蛋白都是大分子的物質(zhì)，輕鏈和重鏈，且具有抗原結(jié)合的部位。第十頁(yè)，共50頁(yè)。 什么是抗

4、原(Antigen) ？ 凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱(chēng)為抗原。物質(zhì)所具有的這種特性稱(chēng)為抗原性?？乖奈镔|(zhì)可以是機(jī)體自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有外來(lái)的抗原（如病毒、污染物）。第十一頁(yè)，共50頁(yè)?？乖奶禺愋?各種抗原物質(zhì)的化學(xué)組成雖然很復(fù)雜，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并與抗體反應(yīng)相結(jié)合的化學(xué)組成，僅僅是抗原物質(zhì)表面的一些具有活性的化學(xué)基團(tuán)、化學(xué)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)型，被稱(chēng)為抗原物質(zhì)決定簇。 分子結(jié)構(gòu)的差異性，決定各種物質(zhì)抗原的特異性。第十二頁(yè)，共50頁(yè)。抗原抗體反應(yīng) 抗原與抗體的反應(yīng)統(tǒng)稱(chēng)為免疫學(xué)反應(yīng)。在體內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱(chēng)為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱(chēng)為血清學(xué)

5、反應(yīng)。 沒(méi)有抗原的刺激，機(jī)體不能產(chǎn)生抗體；利用抗體可以檢測(cè)抗原物質(zhì)。第十三頁(yè)，共50頁(yè)。ELISA法特點(diǎn)ELISA法是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。由于測(cè)定中需要酶標(biāo)記抗原或抗體，酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。第十四頁(yè)，共50頁(yè)。2.常用的ELISA分析1).測(cè)定抗原2).測(cè)定抗體第十五頁(yè)，共50頁(yè)。(1)測(cè)定抗原A將抗體吸附于固相表面，這個(gè)過(guò)程叫包被。B 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物。C 加酶標(biāo)抗體。D 加酶反應(yīng)的底物。反應(yīng)終止時(shí)，反應(yīng)液的顏色深淺與抗原的含量成正比。第十六頁(yè)，共50頁(yè)

6、。主要步驟1.包被抗體的酶標(biāo)板（一抗）。2.加待測(cè)抗原。抗原抗體反應(yīng)，洗滌。3.加酶標(biāo)抗體（二抗）。反應(yīng)，洗滌。4.加顯色底物（三抗），反應(yīng)，洗滌。5.加終止液。6.酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。7.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行定量。第十七頁(yè)，共50頁(yè)。(2)測(cè)定抗體A 抗原包被在酶標(biāo)板。B 加抗體，形成抗原抗體復(fù)合物。C 加酶標(biāo)抗體（一抗）D 加酶底物（二抗），顯色，比色。ABCD第十八頁(yè)，共50頁(yè)。3.ELISA方法的應(yīng)用 原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。 在實(shí)際應(yīng)用中它和醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、環(huán)境學(xué)等方面密切相關(guān)。第十九頁(yè)，

7、共50頁(yè)。舉例醫(yī)學(xué)方面：腫瘤研究中檢測(cè)甲胎蛋白；檢測(cè)過(guò)敏原；檢測(cè)血清中白蛋白及免疫球蛋白；傳染病診斷中檢查乙型肝炎表面抗原。環(huán)境科學(xué)方面：測(cè)定污染物抗原干預(yù)下生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、酶的變化。其他：植物組織漿液中檢查植物病毒；普通比色分析。第二十頁(yè)，共50頁(yè)。二、酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀普通酶標(biāo)儀多功能酶標(biāo)儀第二十一頁(yè)，共50頁(yè)。1.普通酶標(biāo)儀即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(ELISA Reader）Bio-RadModel 5504萬(wàn)元第二十二頁(yè)，共50頁(yè)。光源光電檢測(cè)器電信號(hào)經(jīng)前置放大、對(duì)數(shù)放大、模數(shù)轉(zhuǎn)換等濾光片或單色器酶標(biāo)儀結(jié)構(gòu)及原理第二十三頁(yè)，共50頁(yè)。 光源：鎢燈濾光片：常用的波長(zhǎng)范圍： 405nm 45

8、0nm(四甲基聯(lián)苯胺) 490nm(鄰苯二胺) 630nm單色器：可調(diào)節(jié)波長(zhǎng)的光第二十四頁(yè)，共50頁(yè)。比色裝置： 聚苯乙烯塑料微孔板：96孔光電檢測(cè)器第二十五頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)儀與光度計(jì)的區(qū)別波長(zhǎng)：4-6個(gè)比色裝置：酶標(biāo)板，非比色杯光路：垂直功能：不能波長(zhǎng)掃描；只在固定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光范圍測(cè)定；可對(duì)化學(xué)物及生命組分進(jìn)行終點(diǎn)分析。第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)儀的應(yīng)用普通酶標(biāo)儀基本功能有2個(gè)：（1）相當(dāng)于分光光度計(jì)：測(cè)定化合物含量或者細(xì)胞存活率等。（2）基于免疫反應(yīng)的ELISA分析。新型的多功能酶標(biāo)儀價(jià)格在20-50萬(wàn)元，分析功能得到廣泛拓展，這對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用有深刻的意義。第二十七頁(yè)，共50頁(yè)。ELIS

9、A的局限性世界衛(wèi)生組織專(zhuān)家組提出對(duì)ELISA的評(píng)價(jià)認(rèn)為：“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用是一個(gè)好辦法，但要做好它不容易?！?.對(duì)ELISA法的非特異性評(píng)價(jià)的資料尚不夠完善，因此，對(duì)出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時(shí)候，往往不易解釋。2.固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號(hào)的固相載體有時(shí)本底值較高，有時(shí)吸附性能很差，影響試驗(yàn)結(jié)果。3.試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過(guò)海，各顯神通”，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。第二十八頁(yè)，共50頁(yè)。2.多功能酶標(biāo)儀Thermo公司全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀50多萬(wàn)元第二十九頁(yè)，共50頁(yè)。多功能酶標(biāo)儀的特點(diǎn)1.比色杯或者微孔板（6、12、24、48、96和384孔微孔板 ）

10、,測(cè)樣量大 ；2. 200-1000 nm ，有紫外可見(jiàn)光、熒光、偏振光等,波長(zhǎng)變化可達(dá)到1nm, 只要是有色溶液即可測(cè)定吸光度；3.可提供終點(diǎn)檢測(cè)、動(dòng)力學(xué)、單孔掃描和光譜掃描等測(cè)讀模式 ；4.分析功能擴(kuò)大。第三十頁(yè)，共50頁(yè)。多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用舉例 DNA/RNA定量和純度檢測(cè) Bradford /Lowry實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性檢測(cè) MTT分析 （IC50/LD50 ）細(xì)菌生長(zhǎng)分析 鈣流檢測(cè) 膜電位檢測(cè) 雙熒光素酶報(bào)告基因分析 第三十一頁(yè)，共50頁(yè)。多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ATP檢測(cè) 微生物生長(zhǎng) 綠熒光蛋白分析 藥代毒性分析 膜滲透分析熒光偏振分析 第三十二頁(yè)，共50頁(yè)。第二十六頁(yè)，共

11、50頁(yè)。Bio-Rad Model 550酶標(biāo)儀操作第三十九頁(yè)，共50頁(yè)。 ELISA法的原理是什么？聚苯乙烯塑料微孔板：96孔一般要求有10倍左右的差異為合格。D值的誤差不超過(guò)10%為合格。第三十八頁(yè)，共50頁(yè)。什么是抗體(Antibody)？細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性檢測(cè) 普通酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)為什么選擇雙波長(zhǎng)測(cè)定？第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱(chēng)為抗原。為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽(yáng)光直射。加顯色底物（三抗），反應(yīng)，洗滌。比色裝置：酶標(biāo)板，非比色杯（2）基于免疫反應(yīng)的ELISA分析。第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。也有外來(lái)的抗原（如病毒、污染物）。1971年人們建立了

12、用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，并進(jìn)行定量，這種技術(shù)被稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA。三、酶標(biāo)儀操作 1. 注意事項(xiàng) 2. 酶標(biāo)板 3. 操作要點(diǎn)第三十三頁(yè)，共50頁(yè)。1.注意事項(xiàng)1）反復(fù)研讀試劑盒說(shuō)明，熟悉操作步驟。2）加樣的準(zhǔn)確性。操作中須注意顯色劑和終止的加量準(zhǔn)確，最好使用加樣槍加液以保證比色時(shí)吸光度的準(zhǔn)確性。槍頭不要混用。3）洗滌時(shí)間。一般按照說(shuō)明書(shū)要求，起碼洗滌5次，切要把殘液甩干。第三十四頁(yè)，共50頁(yè)。按箭頭光標(biāo)到D/S,按select選中，enter 確定。保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面，以及足夠的操作空間。選擇n

13、ew session;name;next；按Start，開(kāi)始測(cè)量吸光度，并自動(dòng)打印測(cè)定結(jié)果。6）顯色液要現(xiàn)用現(xiàn)配，避光低溫保存 。世界衛(wèi)生組織專(zhuān)家組提出對(duì)ELISA的評(píng)價(jià)認(rèn)為：“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用是一個(gè)好辦法，但要做好它不容易。可提供終點(diǎn)檢測(cè)、動(dòng)力學(xué)、單孔掃描和光譜掃描等測(cè)讀模式 ；檢測(cè)血清中白蛋白及免疫球蛋白；ELISA法是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。傳染病診斷中檢查乙型肝炎表面抗原。第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。7）注意購(gòu)買(mǎi)抗體的保存。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行定量。D值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的O.490nm(鄰苯二胺)第四十七頁(yè)，共50頁(yè)。二、

14、酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀在體內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱(chēng)為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱(chēng)為血清學(xué)反應(yīng)。試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過(guò)海，各顯神通”，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。放板（in）,save;點(diǎn)擊excute session;開(kāi)始讀板，Results,保存數(shù)據(jù)；4）觀察和判讀吸光度結(jié)果應(yīng)在15min 內(nèi)完成，否則液體顏色會(huì)減退。5）待測(cè)生物樣品要放在4冰浴上。6）顯色液要現(xiàn)用現(xiàn)配，避光低溫保存 。7）注意購(gòu)買(mǎi)抗體的保存。第三十五頁(yè)，共50頁(yè)。2.酶標(biāo)板第三十六頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)板材料可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷

15、、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。由于微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應(yīng)用。第三十七頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)板材料國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板（上海塑料三廠出品）目前已大量應(yīng)用于ELISA測(cè)定，并且獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)證明，吸附效果似乎與塑料的類(lèi)型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。第三十八頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)板鑒定 對(duì)每批制品在使用前，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)

16、每批購(gòu)置的微量反應(yīng)板抽樣，用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)顯色并終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定其O.D值。第三十九頁(yè)，共50頁(yè)。一般認(rèn)為全板中每?jī)煽组gO.D值的誤差不超過(guò)10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格。第四十頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)儀單、雙波長(zhǎng)檢測(cè) 一般的酶標(biāo)儀在測(cè)定中均有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)的模式，為什么呢？第四十一頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)儀是垂直光路，受被測(cè)樣本液面是否水平、酶標(biāo)板透光性、孔底是否平整等的影響較大。選擇 630nm為參比波長(zhǎng), 測(cè)定其吸

17、光度A0;在測(cè)定波長(zhǎng)（如490nm/450nm）下測(cè)定樣本的吸光度A,雙波長(zhǎng)測(cè)定后,取二者的差值, 測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差比單波長(zhǎng)下測(cè)定的要小,實(shí)驗(yàn)誤差小。第四十二頁(yè)，共50頁(yè)。在ELISA測(cè)定所使用的底物如鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，顯色終止后，在 630nm處的吸光度值都只有吸收峰處（490nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，不會(huì)影響檢測(cè)靈敏度。一般酶標(biāo)儀比色應(yīng)該首選雙波長(zhǎng)。第四十三頁(yè)，共50頁(yè)。酶標(biāo)儀的工作環(huán)境1.儀器應(yīng)放置在無(wú)強(qiáng)磁場(chǎng)和干擾電壓的位置。2.儀器應(yīng)放置在噪音低于40分貝的環(huán)境下。3.為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽(yáng)光直射。4.操作環(huán)境溫度應(yīng)在1540之間，環(huán)境

18、濕度在15%85%之間。5.操作時(shí)電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。6.操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽、煙塵。7.保持干燥、干凈、水平的工作臺(tái)面，以及足夠的操作空間。 第四十四頁(yè)，共50頁(yè)。3.Bio-Rad Model 550酶標(biāo)儀操作1.接通電源，打開(kāi)酶標(biāo)儀開(kāi)關(guān)。2.儀器開(kāi)始自檢。Self disgonsis in progress3.按箭頭光標(biāo)到Mode,設(shè)置參數(shù)。當(dāng)儀器出現(xiàn)set analysis mode 時(shí)，按enter確定。4.選擇測(cè)定波長(zhǎng)的類(lèi)型。按箭頭光標(biāo)到D/S,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在Dual/Single，選擇雙波長(zhǎng)，按select選中，enter 確定。第四十五頁(yè)，共50頁(yè)。5.選擇濾光波長(zhǎng)，此酶標(biāo)儀有四個(gè)波長(zhǎng)：1：405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。按箭頭光標(biāo)到Filt,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在Mes=#X Ref=# Y，如按光標(biāo)選擇數(shù)字3，即490nm的測(cè)定波長(zhǎng),enter確定。再按Next, 到Ref,按光標(biāo)選擇參考波長(zhǎng)，如選數(shù)字4.即為630nm