食品酶學試驗-菠蘿蛋白酶重點講義資料

1、食品酶學綜合性實驗實驗1菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測定目的和要求】. 了解酶分離純化的一般程序；.掌握硫酸鏤沉淀法、透析法分離提取菠蘿蛋白酶的基本原理和方法；.熟悉蛋白質(zhì)含量測定、菠蘿蛋白酶活力測定等實驗原理和方法。【實驗原理】.建立有效的酶純化程序應(yīng)考慮的原則(1)利用酶在分離純化上最有利的特性；(2)盡早使用一種選擇性好的方法；(3)選擇交換能力高的層析技術(shù)作為第一步層析；(4)不要連續(xù)使用相同的純化方法；(5)將各層析步驟連接起來，使前一步得到的樣品適用于下一步層析；(6)在造成酶被稀釋的步驟后來要用濃縮酶的方法；(7)要使每步過程的分辨能力呈遞增趨勢；(8)每步純化過程后，

2、通過量體積，酶活力和蛋白質(zhì)濃度測定，監(jiān)測純化的進程。.菠蘿蛋白酶簡介菠蘿蛋白酶(Bromelain , EC 3.4.22.3)簡稱菠蘿酶，是從鳳梨屬植物菠蘿中提取的一組復合的半胱氨酸疏基蛋白水解酶。在食品工業(yè)中菠蘿蛋白酶作為一種食品添加齊I，能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺等，可用于肉質(zhì)嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產(chǎn)等。在醫(yī)藥上它可以治療水腫及多種炎癥。1891年Mercaro于菠蘿的汁中首先發(fā)現(xiàn)。 菠蘿蛋白酶屬于糖蛋白， 是由疏基蛋白酶和非蛋白酶組分構(gòu)成的復雜復合物，因含有一個不穩(wěn)定的游離疏基，所以菠蘿蛋白酶極易被氧化而使其酶活下降。菠蘿蛋白酶的相對分子質(zhì)量大約為33 000DW,等電點9.

3、55,最適pH在7.1左右，在偏酸環(huán)境下酶活下降較快，堿性環(huán)境能延緩失活。 菠蘿蛋白酶的溫度的最穩(wěn)定范圍是 55C65C。金屬鹽離子中NaCl、KCl對酶活的影響不是很大，維 生素C、半胱氨酸、硫代硫酸鈉、2-疏基乙醇是菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定劑，EDTA能通過螯合對酶活有影響的金屬離子而保護菠蘿蛋白酶，有機溶劑中甲醇、乙醇、乙二醇對 酶活損失較大。.菠蘿蛋白酶的粗分離（1）鹽析分離鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。在稀鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃 度的增加而升高，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當鹽濃度增加到一定量時，其溶解度又逐漸 下降，直到某一濃度時便從溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象即為鹽析。利用鹽析作用可使

4、 不同蛋白質(zhì)從溶液中析出從而實現(xiàn)分離。這是因為蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中 性鹽影響下脫去水化層，同時，蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn) 定性遭到破壞而沉淀析出。經(jīng)透析或用水稀釋時又可溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可 逆過程。鹽析不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度與蛋白質(zhì)種類及pH有關(guān)。分子量大的蛋白質(zhì)（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改變鹽濃度，使得不同分子量 的蛋白質(zhì)分別析出。用于鹽析的中性鹽通常有硫酸鏤、硫酸鈉和硫酸鎂等。由于硫酸鏤的溶解度大而溫度系數(shù)小 （在25c時，溶解度為767g/L;在0c時，溶解度為697g/L）, 分離效果好，能保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，且價廉易得

5、，以硫酸鏤最為常用。不同蛋白 質(zhì)鹽析時所需鹽濃度不同，調(diào)節(jié)鹽濃度可適當?shù)貙⒉煌牡鞍踪|(zhì)分開。如雞蛋清中的球蛋白在50%飽和度硫酸鏤溶液中沉淀，清蛋白100%飽和硫酸鏤中沉淀。硫酸鏤的飽和度可從附錄的硫酸鏤飽和度計算表”中查找，計算所需添加的硫酸鏤量。（2） 透析和超濾透析和超濾是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而小分子可以自由透過的性質(zhì)， 使蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)分開。透析是將待提純的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里， 扎緊袋口放在蒸儲水或緩沖溶液中進行。透析時，需不斷更換透析外液，直到透析袋 內(nèi)小分子物質(zhì)降低至內(nèi)外平衡為止。超濾是利用壓力或離心力，借助超濾膜將不同分 子質(zhì)量物質(zhì)分離的技術(shù)。超濾膜是由

6、丙烯晴、醋酸纖維、硝酸纖維、尼龍等高分子聚合物制成的多空薄膜，截留的顆粒直徑為220nm,相當于相對分子質(zhì)量 1 0005X105.超濾技術(shù)不僅使蛋白質(zhì)得以分離純化，還可以達到濃縮的目的。4.菠蘿蛋白酶活性測定酪蛋白是一種蛋白質(zhì)，它被菠蘿蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū)280nm處有最大吸收，且光吸收值與含量成正比，符合Beer定律。根據(jù)測定的280nm處的吸收值， 可判定菠蘿蛋白酶的酶活性。【實驗儀器和用品】.實驗儀器電子天平、恒溫水浴鍋、電磁攪拌器、酸度計、可見紫外分光光度計（配石英比 色杯和玻璃比色杯）、冰箱、高速離心機、臺式天平（離心平衡用）。.實驗用品以組為單位的用品大試管 18mm

7、e 200 mm （10 支）、試管架（2 個）、燒杯（50mLX 1, 100mLX 2,200mLX 1）、滴管（2 支）、玻璃棒（2 支）、移液管（5mLX 1 , 1mLX2, 0.1mL M , 0.2 mL 1）、 漏斗（3個）、量筒 （100mL 1）、研缽、白瓷板、紗布、濾紙、蒸儲水瓶、洗耳球、 標簽紙、橡皮筋。（2）全班共用的用品試劑并瓦 1 1000mLX 7 , 250mLK 3, 60mL 20）、燒杯（1000mLX 4）、塑料燒杯（2000mL 2）、量筒 （500mL8cm透析袋（預先將透析袋在蒸儲水中煮沸30min）中，于500mL燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸

8、儲水透析， 15min換水一次，換水34次后， 檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取 2mLBaCl 2溶液放入一支試管，滴加 23滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示SO42-未除凈，若無沉淀出現(xiàn)，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過濾，測定過濾液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。.酶活力測定方法取2支試管，設(shè)置一支為實驗對照，三支為平行樣品。 取0.1mL酶液，加入0.9mL激活劑，加入 37c預熱的1%酪蛋白溶液1mL,準確反應(yīng)10min,加入10%三氯乙酸 3mL反應(yīng)終止酶反應(yīng)。對照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測定管相同。離心（3000r/min

9、 , 5min ）或過濾，清液于 280nm波長下測定光吸收值。酶 活單位定義：在上述條件下，每10min增加0.001個光吸收值為1個酶單位（U）。實驗步驟按照表格中完成。試劑（ml）對照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3TCA3一一一酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137 C準確反應(yīng)10minTCA333A280nm OD 值.蛋白質(zhì)含量測定方法將酶液稀釋至一定程度，采用考馬斯亮蘭G-250法測定溶液中可溶性蛋白的含量（參照附錄 1）?！窘Y(jié)果計算】.蛋白質(zhì)含量計算 參照附錄1。.酶活力計算最后酶活結(jié)果取3次重復實驗的平均值。A280nm酶液活力（U/mL

10、 ）=3.酶比活的計算漏釋倍數(shù)0.001 0.1酶比活（U/mg蛋白）=酶活力/酶蛋白質(zhì)含量4.酶純化過程中回收率計算回收率（）=（純化酶總活力/粗酶液總活力）M00（純化酶活力義純化酶液體積）/ （粗酶活力X酶體積）X1005.酶純化倍數(shù)的計算純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力6.分析及討論將測定的數(shù)據(jù)整理計算分別填入下表，并菠蘿蛋白酶的分離純化效果進行分析和討論。菠蘿蛋白酶分離純化表步驟 總體積 總蛋白質(zhì)含 總活力 比活力 回收率 純化倍數(shù)（mL）量（mg）（U）（U/mg 蛋 （）白）粗提取鹽析透析【注意事項】.酶活性測定時的反應(yīng)時間一定要準確，并嚴格控制好反應(yīng)時的溫度。.高速離心前一定

11、要平衡好離心管。.注意透析袋是否破裂，透析時間長時要置于4 c下進行?！舅伎碱}】.如何防止酶在分離純化過程中發(fā)生變性失活。.常見的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U/mg蛋白質(zhì)；U/g干重或鮮重；U/g酶粉等）？它們各有什么含義，適用哪些場合？.蛋白質(zhì)的沉淀作用還有哪些方法？哪些變性了？哪些沒有變性？.實驗中硫酸鏤鹽析為什么要選擇0%30%飽和度？【參考書目】.李建武，蕭能，余瑞元等，生物化學實驗原理和方法，北京，北京大學出版社，1994.余冰賓.生物化學實驗指導.北京：清華大學出版社，2003.趙亞華，高向陽.生物化學與分子生物學實驗技術(shù)教程.北京：高等教育出版社，2005附錄1實驗

12、考馬斯亮藍G250染色法測定蛋白質(zhì)含量【目的和要求】掌握考馬斯亮藍 G250法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！緦嶒炘怼靠捡R斯亮藍G250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G250在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm,后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) （01000科g/mL）,蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在波長 595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍G250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測微克級蛋白質(zhì)含量。大量的去污劑對測定有嚴重

13、的干擾，少量可通過對照消除。由于此法簡便迅速、干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛 用于蛋白質(zhì)含量的測定?！緦嶒炂鞑摹糠止夤舛扔?、離心機、分析天平（萬分之一）、藥物天平、研缽、燒杯、量筒（10mL XI）、容量瓶（100mL X1）、刻度吸管（lmLX1, 0.lmL X 1）、具塞刻度試管（10mL XI）、漏斗、漏斗架、剪刀。【實驗材料及試劑】（1）樣品溶液。（2）標準溶液：準確稱取 100mg牛血清白蛋白，溶于 100mL蒸儲水中，即為1000 g/mL的原液。（3）染液：稱取0.1g考馬斯亮藍G250溶于50mL90 %乙醇溶液中，再力口入100mL 85 % 的磷酸，最后用蒸儲水定容至 1

14、000mL o此溶液在室溫下可放置一個月。【實驗步驟】1標準曲線的繪制（1） 01000 g/mL標準曲線的繪制：另取 6支試管編號，按下表加入試劑。1234561000 V g/mL牛血清白蛋白（mL）00. 20. 40. 60. 81.0蒸儲水（mL）1.00. 80. 60. 40. 20蛋白質(zhì)濃度（11 g/mL ）02004006008001000得到從1到6號管的牛血清白蛋白溶液濃度分別為0、200、400、600、800、1000dg/mL ,準確吸取各管溶液0.lmL ,加入5ml考馬斯亮藍溶液， 搖勻，靜置2min ,測定595nm 吸光值，繪制0-1000g/mL標準曲線

15、。2.樣品的測定準確吸取樣品溶液0.1mL放入具塞刻度試管中，與步驟（1）操作相同，測得樣品的光吸收值 A595nm0【結(jié)果計算】由標準曲線可查出相應(yīng)的蛋白濃度（g/mL）,可按如下公式計算出樣品中蛋白含量。查出的蛋白提取液濃度(聞/mL) X定容體積(mL)樣品蛋白含量(闖/g鮮重)=樣品重量(g)【注意事項】.比色應(yīng)在出現(xiàn)藍色 2min1h內(nèi)完成。.測定中，蛋白染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，測定完后可用乙醇浸泡將比 色杯上的藍色清洗干凈?！舅伎碱}】.考馬斯亮藍 G-250法測定蛋白質(zhì)含量的原理是什么？.比較雙縮月尿法、Folin-酚法、紫外吸收法、考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含

16、量的優(yōu)缺點?！緟⒖紩俊縄.Bradford , M.M. , Anal. biochem ： 1976, 248-2542.李建武，蕭能，余瑞元等.生物化學實驗原理和方法.北京：北京大學出版社，1994附錄2硫酸俊飽和度計算表(1)調(diào)整硫酸錢溶液飽和度計算表(25。)10202530333540455055606570758090100每1L 溶液加固體硫酸鏤的g 數(shù)州05611411417619620924327731335139043047251656166276710578611813715018321625128832636540644949459269420295978911231

17、551892252623003403824245206192530496193125158193230267307348390485583301930629412716219823527331435644954633124374107142177214252292333426522353163941291642002382783194115064031639713216820524528537546945326599134171210250339431503366101137176214302392553367103141179264353603469105143227314653470107

18、190275703572153237753611519880771579079硫度度初濃%飽 和酸鏤硫 酸 鏤濃 度， 飽 和 度* 在25 C下，硫酸氨溶液由粗濃度調(diào)到終濃度時，每L溶液所加固體硫酸鏤的 g數(shù)10(2)調(diào)整硫酸錢溶液飽和度計算表(0幻)在0 c 硫 酸 鏤 終 濃 度， 飽 和 度20253035404550556065707580859095100硫 酸 鏤 初 濃度% 飽和 度，.、.一.、一，.，、，、，.，*每100mL 溶凝加固體硫酸鏤的g 數(shù)010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7152.65.48.211.114.117.220.423.727.130.634.338