抗遲緩愛(ài)德華菌獨(dú)特型單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列分析

1、抗緩慢愛(ài)德華菌奇特型單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列闡發(fā)秦紅,黃威權(quán)，楊向民,溫偉紅,楊安鋼、【關(guān)鍵詞】緩慢愛(ài)德華菌;,抗奇特型抗體;,基因克隆;,序列闡發(fā)摘要目的:克隆并闡發(fā)緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型單克隆抗體AbVH基因。要領(lǐng):從排泄緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型Ab的雜交瘤細(xì)胞株1E11中提取總RNA,利用RTPR技能,擴(kuò)增緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型抗體VH基因,并將其克隆到PBSTvetr中舉行序列闡發(fā)。效果:VH基因的全長(zhǎng)序列為339bp,編碼113個(gè)氨基酸。通過(guò)NBI/BLAST/N和IGT數(shù)據(jù)庫(kù)Lefrane,2001闡發(fā)表白,VH基因切合小鼠IgGV區(qū)基因的特性:含有4個(gè)框架區(qū)FR,3個(gè)抗原互補(bǔ)

2、決定區(qū)DR及兩個(gè)抗體特性性的半胱氨酸。結(jié)論:樂(lè)成地克隆了緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型AbVH基因,為進(jìn)一步構(gòu)建緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型抗體基因工程疫苗奠基了基矗關(guān)鍵詞緩慢愛(ài)德華菌;抗奇特型抗體;基因克隆;序列闡發(fā)緩慢愛(ài)德華菌(Edardsiellatarda)是淡、海水養(yǎng)殖魚類的一種最重要的病原菌1,具有很強(qiáng)的致病性,其熏染具有盛行面積廣、發(fā)病率及殞命率高等特點(diǎn),是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中危害最大的一種疾玻該菌的宿主范疇較普及,常能從多種冷血?jiǎng)游?、鳥(niǎo)類、溫血脊椎動(dòng)物及情況中分散出2,可引起人類的種種熏染胃腸炎、敗血癥、肝膿腫、腦膜炎、傷口熏染等。臨床表示為腹瀉、水樣便、伴吐逆、腹痛及低熱等。別的,亦有報(bào)道緩慢愛(ài)德華菌

3、可引起肝膿腫、腦膜炎及軟構(gòu)造熏染等的報(bào)道3。如今,海內(nèi)對(duì)該菌的治療仍舊是應(yīng)用種種抗生素等藥物,如在餌料中添加適量的土霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺類藥物等,并按期用福爾馬林藥裕但恒久應(yīng)用抗生素易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等負(fù)面影響4,5。歐、美等國(guó)度已有將弧菌、氣單胞菌及愛(ài)德華菌等制成滅活疫苗,并從中提取多糖、胞外卵白等有用抗原,制備了單克隆抗體Ab工程疫苗,且已商品化消費(fèi)。由于滅活疫苗的抗原性較弱,而減毒疫苗的寧?kù)o性不不變,為此,研制利用便利、高效、易商品化大范圍消費(fèi)、實(shí)在有用的疫苗,對(duì)水財(cái)產(chǎn)甚為需要。我們初次從排泄抗緩慢愛(ài)德華菌奇特型Ab的雜交瘤細(xì)胞株1E11中提取總RNA,并以

4、RTPR樂(lè)成克隆了該Ab的VH基因。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料排泄抗緩慢愛(ài)德華菌奇特型Ab的雜交瘤細(xì)胞株1E11為本室創(chuàng)立6。RPI1640干粉為GibBRL公司產(chǎn)物。RNA抽提試劑TRIzlTReagents購(gòu)自TaKaRa公司。RTPR試劑盒為美國(guó)Invitrgen公司產(chǎn)物。質(zhì)粒提取試劑盒和膠接納試劑盒,均購(gòu)自北京博大泰克公司。PR試劑,毗連試劑和pBSTvetr均購(gòu)自北京天為期間公司。1.2要領(lǐng)緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型AbVH基因的擴(kuò)增:清醒排泄抗緩慢愛(ài)德華菌奇特型Ab的雜交瘤細(xì)胞株1E11,傳至3代使細(xì)胞數(shù)量達(dá)2.8107/L后勞績(jī)細(xì)胞。用TRIzlTReagents、氯仿和異丙醇抽提RNA后

5、,以無(wú)水乙醇沉淀。以11LRNA為模板,以ligdT20為隨機(jī)引物,反轉(zhuǎn)錄合成DNA第1鏈。PR引物序列:Bak:5ATGAAATGAGTGGGGAT(,G)TTTT3;Fr:5AGTGGATAGAAGATGGGGG3。在25L反響體系中,參加DNA2L,Bak和Fr引物各1L舉行PR。反響參數(shù)為:于94變性5in后,94、1in,50、1in,72、1in,共25次循環(huán)后,于72再延伸10in。PR產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳斷定。2效果2.1RTPR擴(kuò)增產(chǎn)物的斷定經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳斷定表白,VH基因的RTPR產(chǎn)物巨細(xì)為420500bp圖1。圖1Ab1E11VH基因RTPR產(chǎn)物的瓊

6、脂糖凝膠電泳闡發(fā)略1:DL2000DNAarker;2:VH基因的RTPR產(chǎn)物.2.2VH基因的克隆及序列闡發(fā)將PR擴(kuò)增的VH基因膠接納后,克隆入pBSTvetr載體中,并轉(zhuǎn)化E.liDH5的感覺(jué)態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)Xgal藍(lán)白挑選后,挑取陽(yáng)性克隆,經(jīng)菌落PR斷定準(zhǔn)確后舉行測(cè)序。測(cè)序效果經(jīng)IGT數(shù)據(jù)庫(kù)Lefrane,2001闡發(fā)表現(xiàn),VH基因具有小鼠IgGVH基因的特性,含有3個(gè)DR區(qū),4個(gè)FR區(qū)和兩個(gè)抗體特性性的半胱氨酸(圖2)。圖2抗緩慢愛(ài)德華菌奇特型AbVH基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列略3討論克隆得到準(zhǔn)確的抗體輕、重鏈可變區(qū)基因,是制備基因工程抗體中最緊張也是最關(guān)鍵的一步。由于在RTPR而得到

7、的雜交瘤細(xì)胞株的DNA中,一些非復(fù)制的重排片斷是最正確的PR模板;并且在舉行細(xì)胞融適時(shí)大概交融不止一個(gè)脾細(xì)胞至骨髓瘤細(xì)胞,從而導(dǎo)致多種成效性以及非成效性V區(qū)基因產(chǎn)生。因此在做PR克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因時(shí),大概會(huì)克隆出除目的基因以外無(wú)關(guān)的輕重鏈基因。別的,由于V區(qū)基因內(nèi)部的5端和3端的突變大概會(huì)按捺引物退火而攔阻擴(kuò)增反響。因此我們接納了抗體重鏈可變區(qū)基因5端的信號(hào)肽,及3端恒定區(qū)的通用引物,通過(guò)NBI/BLAST/N和IGT數(shù)據(jù)庫(kù)Lefrane,2001將PR出的基因序列舉行闡發(fā),尋出抗體重鏈可變區(qū)的基因序列,并在盤算機(jī)上舉行Blast綜合闡發(fā),顛末以上研究事情的重復(fù)論證,以確?？贵w重鏈可變

8、區(qū)基因的完備和正確。效果,通過(guò)Blast闡發(fā)未見(jiàn)雷同序列。我們得到的抗體重鏈可變區(qū)VH基因共編碼113個(gè)氨基酸,序列中無(wú)停頓暗碼子,為一開(kāi)放讀框;具有4個(gè)FR,3個(gè)DR和維持抗體V區(qū)空間布局所必須的2個(gè)特性性的半胱氨酸,別離位于第22位和第96位,為VDJ重排,切合小鼠IgGVH基因特性。同源性闡發(fā)表白,我們所得到的VH基因與GenBank中序列號(hào)為13832.1(Identities96%)和U88672.1(Identities93%)序列相似性較高,它們均為小鼠重鏈可變區(qū)基因。緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型Ab重鏈可變區(qū)VH基因的樂(lè)成得到,為制備新型、有用的緩慢愛(ài)德華菌抗奇特型基因工程抗體奠基了基

9、矗參考文獻(xiàn):1AandiA,HiuSF,RhveJS,etal.IslatinandharaterizatinfEdardsiellatardafrfallhinksaln(nrhynhustshaytsha)J.ApplEnvirnrbil,1982,43:1380-1384.2hiteFH,SipsnF,illiasLEJr.IslatinfEdardsiellatardafraquatianialspeiesandsurfaeatersinFlridaJ.JildlDis,1973,9:204-208.3HltJG,KriegNR,SneathPHA,etal.Bergeysanualfdeterinativebaterilgy.(NinthEditin),Baltire,illiasandilkins,1994:190-194,253-274.4張曉君,戰(zhàn)文斌,陳翠珍,等.牙鲆癡鈍愛(ài)德華菌熏染癥及其病原的研究J.水生生物學(xué)報(bào),2022,291:31-37.5AkiT,EguasS,atanbeT.De