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文檔簡介
1、楚雄師范學(xué)院本科畢業(yè)論文(設(shè)計)開題報告書題 目核桃內(nèi)生真菌抗菌活性的初步研究姓名段亞霞學(xué)號20081053136系(院)化學(xué)與生命科學(xué)系專 業(yè)科學(xué)教育指導(dǎo)教師2011年12月30日論文(設(shè)計)題目 核桃內(nèi)生真菌抗菌活性的初步研究選題的動因與根據(jù)(說明選擇本課題的理論價值、實踐意義;綜述國內(nèi)外有關(guān)本 課題的研究動態(tài)及見解)核桃(Juglans regiaL.)是核桃屬植物中分布最廣、經(jīng)濟(jì)價值最高的栽培種1。作為一種高級綠色食品,自古以來,核桃的保健功能就為人們所認(rèn)識和推崇, 有萬歲子、長壽果之稱。本草綱目中也有補氣養(yǎng)血、潤燥化炎、益命門、利三 焦、溫肺潤腸等功能的記載。核桃是楚雄的主要經(jīng)濟(jì)作物
2、,其果仁營養(yǎng)豐富,脂 肪含量60%75%,脂肪中的不飽和脂肪酸占90%以上,其中對人體最具醫(yī)療保健作 用的亞油酸占65%以上;蛋白質(zhì)含量15%22%,其中人體可吸收性蛋白與大豆、花 生、杏仁、榛子、雞蛋相比是最高的,在96%以上,深受人們喜愛。植物內(nèi)生真菌(Plant endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定階段或 全部階段生活于健康植物各種組織器官內(nèi)部的真菌,被感染的宿主植物(至少是 暫時)不表現(xiàn)出外在癥狀,可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分 離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生。內(nèi)生真菌長期生 活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化。一方
3、面植物體為其提供生長必需 的營養(yǎng)和能量;另一方面,內(nèi)生真菌又可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號傳導(dǎo) 作用對植物體產(chǎn)生影響。許多植物體內(nèi)都存在著特殊的內(nèi)生真菌,它們在植物體內(nèi)作為生防菌,能有 效地防治植物病害,增強(qiáng)植物對病原菌的抗性。近幾年,人們在植物內(nèi)生真菌防 治植物病害方面進(jìn)行了大量的研究。植物內(nèi)生真菌的生防機(jī)制是其分泌抗菌物 質(zhì)、與病菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、產(chǎn)生植物激素等。但其作為 植物病害生防因子進(jìn)行開發(fā)與應(yīng)用中還存在一些問題。2009年翟梅枝等人發(fā)表 核桃屬內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性研究表明核桃和黑核桃的內(nèi)生真菌有廣 泛的抗菌譜,對棉花立枯病菌、蘋果炭疽病菌、梨黑星病菌、小
4、麥赤霉病菌和油 菜菌核病菌菌絲生長具有抑制作用。近年來,植物病害的生物防治研究越來越受到人們的重視。從植物體獲得的 內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)具有農(nóng)藥活性的物質(zhì),成為無公害生物性農(nóng)藥創(chuàng)制的一條途徑。資 料表明目前關(guān)于核桃內(nèi)生真菌的分離及抗菌活性的研究,尚未見報道,本研究的 目的在于分離出核桃中的內(nèi)生真菌并對其進(jìn)行抗菌活性研究,篩選出具抗菌活性 的核桃內(nèi)生真菌,并了解其最適溫度等情況,初步了解其最適生長條件。以期為 今后挑選核桃內(nèi)生真菌來防治核桃病害提供優(yōu)良的種質(zhì)資源提供一定的依據(jù),從 而為植物病害的防治向無公害性農(nóng)藥發(fā)展提供一定的依據(jù)。課題的主要內(nèi)容:核桃內(nèi)生真菌的轉(zhuǎn)接及純化核桃內(nèi)生真菌的活化核桃內(nèi)生真菌的
5、鑒定核桃內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)供試病原菌的活化病原菌的液體發(fā)酵抑菌實驗溫度對具抗菌活性核桃內(nèi)生真菌得影響。研究方法:核桃內(nèi)生真菌的轉(zhuǎn)接及純化:將分離保存的22株核桃內(nèi)生真菌在無菌條件下轉(zhuǎn) 接于PAD斜面試管中,28C下恒溫培養(yǎng)34天。菌株活化后;挑菌絲三點種于PDA 培養(yǎng)基上純化培養(yǎng),72h時觀察并記錄菌落形態(tài)。將已純化菌種轉(zhuǎn)接于PAD斜面試 管中培養(yǎng)7天,置于4C的冰箱中冷凍保藏。核桃內(nèi)生真菌的活化:在無菌操作下,將核桃內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基中,28C 下恒溫培養(yǎng)34天,備用。核桃內(nèi)生真菌的鑒定:插片法觀察真菌形態(tài)特征,即將純化的菌株接種到PDA培 養(yǎng)基上,在接種部位上方斜插入蓋玻片(3到4
6、片為宜)使蓋玻片與培養(yǎng)基平面呈 45度角,28C下恒溫培養(yǎng)7天。將蓋玻片取出,長菌絲一面朝向載玻片上方,置 于顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征及孢子形態(tài),參照文獻(xiàn)進(jìn)行菌株的鑒定閭核桃內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng):將已鑒定的內(nèi)生真菌菌株接種于PDA平面固體培養(yǎng) 基上活化,28C培養(yǎng)46d,待菌落長至直徑4050 mm,在無菌條件下用竹簽挑 取適量的菌落至含50 mL PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中(250 mL ),在28 C, 120r/ min搖床上震蕩培養(yǎng)7d,在培養(yǎng)液中加入20ml乙酸乙酯在28C,120r/ min搖床 上震蕩培養(yǎng)24h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽提菌液備用。供試病原菌的活化:將擬盤多毛孢、
7、鏈格孢、德氏孺孢、灰葡萄孢和疫霉5種致 病菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)46天,活化用于抑菌實驗。6病原菌的液體發(fā)酵:將活化好的病原菌在無菌條件下用竹簽挑取適量的菌落至含 50mLPDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中( 250 mL ),在28C,120r/ min搖床上震蕩培 養(yǎng)7d,備用。抑菌實驗:抑菌實驗采用濾紙片法,分別將幾種致病菌一定量的發(fā)酵液均勻的涂 在固體PDA培養(yǎng)基表面,將直徑7mm的無菌濾紙片用抽提液浸濕濾紙,放于培養(yǎng) 基上,每個樣品做三份,取無菌平板作對照實驗,28C恒溫培養(yǎng)48h,測量抑菌圈 的直徑。8、溫度對具抗菌活性核桃內(nèi)生真菌得影響:將具抗菌活性的核桃內(nèi)生真菌接種到 PD
8、A固體平板中,其它條件不變的情況下分別至于4C、10C、20C、28C、37C、 45 C培養(yǎng)72h天,并測量各個溫度下的菌落直徑,同時對菌落特征進(jìn)行觀察記錄。完成期限和采取的主要措施:1.2011年12月1日到2011年12月30查找資料并對資料進(jìn)行整理,編寫開題調(diào) 查報告。2.2012年3月初到2012年4月中旬對核桃內(nèi)生真菌進(jìn)行分離及抗菌活性研究,并 做好數(shù)據(jù)記錄。3.2011年4月中旬到5月中旬對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,并撰寫畢業(yè)論文。4.2011年5月中旬到5月底進(jìn)行論文答辯。主要參考資料:翟梅枝,高智輝,徐文濤等.核桃內(nèi)生真菌G8菌株的分離鑒定及抑菌活性J.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,20
9、08, 28 (4).劉玲,陳朝銀.核桃功能研究進(jìn)展J.安徽農(nóng)業(yè)科技,2009 , 37 (27).孫龍生.核桃的經(jīng)濟(jì)價值M.楊春平,陳華保,吳文君等.植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性及潛在應(yīng) 用價值J.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005, 14 (2).王偉,翟梅枝,徐文濤等.核桃內(nèi)生菌的分離及代謝產(chǎn)物活性研究J.西北 農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008, 17 (1).楊玉鋒,李保利.植物內(nèi)生真菌在植物病害生物防治中的作用J.河南農(nóng)業(yè) 科學(xué),2011, 40 (3).翟梅枝,問小強(qiáng),劉楓等.核桃屬植物內(nèi)生真菌的分離及其抑菌活性研究J.西北林學(xué)院學(xué)報,2009, 24 (3): 144147.(美)巴尼特,H.L.,亨
10、特B.半知菌屬圖解(第三版)M.沈崇堯譯.北: 科學(xué)出版社,1977, 54211.指導(dǎo)教師意見:(簽名):2012年1月10日開題報告會紀(jì)要時間地點與會人員姓名職務(wù)(職稱)姓名職務(wù)(職稱)姓名職務(wù)(職稱)王振吉講師李雪玲副教授陳華紅教授邙粉良助教會議記錄摘要:陳華紅老師提出論文題目不合理。答:經(jīng)過陳華紅老師的指導(dǎo),將論文題目改成核桃內(nèi)生真菌抗菌活性的初步 研究。陳華紅老師提出研究核桃的目的方面寫的太少,再加上一部分為何要研究核桃 的目的。答:經(jīng)過在下面仔細(xì)查閱后,再在選題的動因與根據(jù)中加上了 “核桃是楚雄 的主要經(jīng)濟(jì)作物,其果仁營養(yǎng)豐富,脂肪含量60%75%,脂肪中的不飽和脂肪酸占 90%以上,其中對人體最具醫(yī)療保健作用的亞油酸占65%以上;蛋白質(zhì)含量1
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