宏基因組學(xué)的研究報(bào)告

1、因組學(xué)研究進(jìn)展及其應(yīng)用摘要：本文先簡(jiǎn)要介紹了當(dāng)前生物化學(xué)的一些研究熱點(diǎn)，再針對(duì)因組學(xué)展開(kāi)論述，介紹了因組學(xué)的產(chǎn)生背景和概念，當(dāng)前的研究進(jìn)展及應(yīng)用。因組學(xué)嘗試通過(guò)免培方法獲得微生物的純培養(yǎng)，主要技術(shù)包括DNA的提取、文庫(kù)的構(gòu)建和目標(biāo)基因克隆的篩選，可用于開(kāi)發(fā)新型酶、發(fā)現(xiàn)新基因、篩選醫(yī)藥等方面。關(guān)鍵字：因組學(xué)；因組學(xué)根本策略；文庫(kù)構(gòu)建與篩選；因組學(xué)研究進(jìn)展及其應(yīng)用引言：微生物是地球上種類(lèi)最多、數(shù)量最大、分布最廣的生物群。僅原核生物（細(xì)菌和古細(xì)菌）即構(gòu)成地球生物總量的的2550%1。自然條件下，包括病毒在的微生物,通過(guò)群落廣泛參與C、N、O和S等重要元素的循環(huán)轉(zhuǎn)化，在人體的食物消化、毒素降解及機(jī)體免

2、疫反響，環(huán)境污染物降解等方面發(fā)揮著重要作用2。人們對(duì)于微生物的研究主要是建立在純培養(yǎng)根底上，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)純培養(yǎng)方法估計(jì)的環(huán)境微生物多樣性只占總量的0.1%1%3，多達(dá)99%以上的微生物是不可培養(yǎng)的,其中蘊(yùn)含著巨大的應(yīng)用潛能其代產(chǎn)物中可能有眾多具有應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值的化合物4。為了研究不能培養(yǎng)的微生物，一個(gè)全新的理念因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)不需預(yù)先培養(yǎng)就能開(kāi)發(fā)這些微生物基因組，目前已廣泛應(yīng)用于微生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用、環(huán)境微生物種群分布及動(dòng)態(tài)變化分析等方面的研究5。因組學(xué)的提出為解決上述問(wèn)題提供了一個(gè)可行途徑。因組學(xué)以生境中全部DNA作為研究對(duì)象，通過(guò)克隆、異源表達(dá)來(lái)篩選有用基因及其產(chǎn)物。由于突破

3、了傳統(tǒng)研究領(lǐng)域無(wú)法涵蓋不可培養(yǎng)微生物的瓶頸，因組學(xué)概念及研究方法一經(jīng)提出，就被廣泛承受。盡管在方法上還存在一定缺陷，但并不阻礙不同領(lǐng)域?qū)W者利用該方法來(lái)研究各種生境中微生物生態(tài)以及篩選功能基因的熱情，有關(guān)因組學(xué)研究的文章逐年增多4。因組學(xué)的概念因組(metagenome)的概念是指從生境樣本中取得全部微生物的基因組,而不是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)微生物的基因組。因組的樣本既包括可培養(yǎng)的微生物，也包括更大量的傳統(tǒng)方法無(wú)法研究的不可培養(yǎng)微生物6。而所謂因組學(xué)(也稱(chēng)元基因組學(xué)Metagenomics、微生物環(huán)境基因組學(xué)MicrobialEnvironmentalGenomics、生態(tài)基因組學(xué)Ecogenomic

4、s)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群構(gòu)造、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、構(gòu)建文庫(kù)和功能分析篩選等工作7。因組學(xué)的根本策略及方法因組學(xué)的根本策略因組學(xué)的研究還處于初期開(kāi)展階段，但其研究的根本過(guò)程和根本策略已根本清楚。在此要強(qiáng)調(diào)的是，因組學(xué)研究有著明確的指導(dǎo)思想，它是在反向生物學(xué)原那么指導(dǎo)下，基于特定生態(tài)環(huán)境根底上，依據(jù)整體、系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)變化和相互作用的觀點(diǎn)，運(yùn)用特殊的技術(shù)路線(xiàn)和方法，對(duì)研究圍中所有基因組展開(kāi)研究的學(xué)科。因組學(xué)是一種整體性的研究策略，它建立在微生

5、物基因組學(xué)的迅速開(kāi)展和聚合酶鏈?zhǔn)椒错憦V泛應(yīng)用的根底之上，是一種不依賴(lài)于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)，涵蓋了生物信息統(tǒng)計(jì)分析和基因組兩方面的意義和技術(shù)，其策略是從特定環(huán)境中直接別離所有微生物DNA,將大片段的DNA克隆到受體菌中表達(dá)，然后根據(jù)某些生物活性篩選有應(yīng)用價(jià)值的克隆。8因組學(xué)研究的根本方法因組學(xué)以基因組技術(shù)為根底，根本程序包括：環(huán)境樣品中因組的提取，將DNA克隆到載體中;載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌建立環(huán)境基因組文庫(kù)，環(huán)境基因組文庫(kù)分析和篩選。近年來(lái)，隨著新一代高通量、低本錢(qián)測(cè)序儀的問(wèn)世，因組的研究可對(duì)特定生境中的基因組片段直接進(jìn)展測(cè)序而不用構(gòu)建文庫(kù)，從而防止了在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中利用細(xì)菌對(duì)樣品進(jìn)展克

6、隆以及克隆中引起的偏差，簡(jiǎn)化了因組研究的根本操作，提高了測(cè)序效率，極促進(jìn)了因組學(xué)開(kāi)展9。因組DNA的提取環(huán)境樣品DNA的提取是文庫(kù)構(gòu)建中最重要、最關(guān)鍵的一步，不僅要盡可能地將環(huán)境中所有微生物的DNA提取出來(lái)，還要保證一定的DNA片段長(zhǎng)度和完整性。另外，環(huán)境樣品中都含有一定的雜質(zhì)（如土壤中的腐殖酸類(lèi)物質(zhì)），這些物質(zhì)可抑制分子克隆中多種酶的活性，因此必須將其除去10。目的樣品的采集須嚴(yán)格遵循取樣規(guī)那么，使樣品能最好地代表自然狀態(tài)下的微生物狀態(tài)9。根據(jù)提取因組前是否別離細(xì)胞，提取方法可分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法主要是通過(guò)去污劑處理（如SDS）,酶解法（如蛋白酶K）等直接破碎樣品中的微生物

7、而使DNA得以釋放。由于無(wú)須對(duì)樣品微生物進(jìn)展復(fù)性，且黏附于顆粒上的微生物細(xì)胞亦能被裂解，原位裂解所得DNA能更好地代表樣品微生物的多樣性，且操作簡(jiǎn)單，本錢(qián)低，DNA提取率高。但該法提取的DNA片段較?。?50kb），通常適用于構(gòu)建小片段文庫(kù)的DNA提取11。異位裂解法先用物理方法將微生物從樣品中別離出來(lái)，然后采用較溫和的方法抽提DNA,可獲得純度較高的大片段DNA（20500kb），但該法操作繁瑣，一些微生物基因組在別離過(guò)程中可能喪失，溫和條件下一些細(xì)胞壁較厚的微生物DNA抽提不出來(lái)，提取率較低且本錢(qián)高，通常適用于構(gòu)建大片段插入文庫(kù)的DNA提取12。因組文庫(kù)構(gòu)建與篩選因組文庫(kù)的構(gòu)建沿用了分子克

8、隆的根本原理和技術(shù)方法，并根據(jù)具體環(huán)境樣品的特點(diǎn)和建庫(kù)目的采取了一些特殊的步驟和策略。構(gòu)建因組文庫(kù)的技術(shù)主要包括：提取和純化環(huán)境微生物DNA、選取適宜的克隆載體以及選擇宿主菌株。根本原那么是以別離獨(dú)立基因或者一些編碼新代功能的小操縱子為目的時(shí)，以小插入片段載體（如質(zhì)粒）構(gòu)建文庫(kù)，提取和純化DNA時(shí)只需考慮純度和物種的豐度13；而大插入片段文庫(kù)（如Cosmid、Fosmid或者BAC）適合于獲取編碼復(fù)雜生物合成途徑的大基因片段或者基因簇，但是構(gòu)建這種文庫(kù)需要提取和純化更高長(zhǎng)度和純度質(zhì)量要求的DNA。載體選擇DNA提取后就可以構(gòu)建文庫(kù)。在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，載體是文庫(kù)構(gòu)建所必需的因素,而且在活性物質(zhì)篩

9、選是也發(fā)揮極其重要的作用。載體選擇的原那么主要考慮是否有利于目標(biāo)基因擴(kuò)增、表達(dá)及在篩選細(xì)胞毒類(lèi)物質(zhì)時(shí)表達(dá)量的調(diào)控等。篩選目標(biāo)物不同，其載體不同,篩選技術(shù)手段也有所不同。由于活性物質(zhì)多是微生物的次生代物，其代途徑由多基因調(diào)控。因此，有必要盡量插入大片段DNA以獲得完整的代途徑多基因簇，以期到達(dá)預(yù)期目的宿主選擇宿主在篩選目標(biāo)物的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。選擇宿主主要考慮重組體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)化效率、因表達(dá)量、篩選的目標(biāo)性狀缺陷型(如溶血或抗菌)等因素。GUNNARHAGELINA等14指出，微生物種類(lèi)不同，其所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類(lèi)型明顯不同。因此，應(yīng)結(jié)合不同的研究目的和篩選不同的活性物質(zhì)考慮選

10、擇與其相適應(yīng)的宿主菌株。因文庫(kù)的篩選目前對(duì)環(huán)境因組文庫(kù)篩選有3種途徑:功能的篩選(functiondrivenscreening、)序列的篩選(sequencedrivenscreening)口底物誘導(dǎo)基因表達(dá)技術(shù)的篩選(substrateinducedgeneexpressionscreening,SIGE。X)由于因組的高度復(fù)雜性,需要通過(guò)高通量和高靈敏度的方法來(lái)篩選和鑒定文庫(kù)中的有用基因。篩選技術(shù)大致可分為3類(lèi)15，基于核酸序列差異分析的篩選、基于克隆子的特殊代活性(功能驅(qū)動(dòng))的篩選、基于底物誘導(dǎo)基因的表達(dá)的篩選，也叫SIGEX法(Substrateinducedgeneexpressi

11、onscreeningmeth16o。d)因組文庫(kù)的分析根據(jù)不同的研究目的，因組文庫(kù)的分析可以從生物活性水平、化合物構(gòu)造水平以及DNA序列水平設(shè)計(jì)不同的篩選方案，可分為功能分析和序列分析。功能分析根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)展篩選,可用于檢測(cè)編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)。例如從文庫(kù)中篩選能表達(dá)抗菌物質(zhì)的克隆。功能分析法根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)展篩選,可用于檢測(cè)編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)8。序列分析有2種主要方法:一種是根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物或探針，通過(guò)PCR擴(kuò)增或雜交來(lái)篩選目的克隆。另一種方法是對(duì)含有16SrRNA等系統(tǒng)進(jìn)化錨定基因的克隆進(jìn)展測(cè)序。一個(gè)典型的

12、因組分析涉及多個(gè)輪次,以確保從生態(tài)環(huán)境標(biāo)本中別離到目,及盡可能多地分析DNA序列所編碼的信息。因組序列分析技術(shù)的進(jìn)步近年開(kāi)展起來(lái)的高通量基因組測(cè)序技術(shù)17，不需要克隆或PCR便能獲取大量的DNA序列信息，相應(yīng)地需要有新的方法來(lái)比擬這些因組數(shù)據(jù)，不斷進(jìn)步的序列分析技術(shù)以及眾多生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫(kù)便利,如針對(duì)原核微生物因組進(jìn)展分析的軟件交互分析和比擬的因組分析工具M(jìn)EGANDNA,所以給基因的鑒定歸屬帶來(lái)很大困難有 5 kb 以上的片段可進(jìn)展有效的鑒定歸類(lèi)，這一問(wèn)題21此外,比擬因組技術(shù)、基因芯片技術(shù)等均可用于分析因組序列18的出現(xiàn)將為因組數(shù)據(jù)的分析提供J Coas1t9、可對(duì)多組因組數(shù)據(jù)進(jìn)展等

13、 20。由于因組技術(shù)提取的是環(huán)境總（這一過(guò)程被稱(chēng)為binning） ，現(xiàn)今只DNA 條形碼技術(shù)已被用來(lái)嘗試解決22 。因組學(xué)研究進(jìn)展及其應(yīng)用近年來(lái),因組學(xué)研究已滲透到各個(gè)研究領(lǐng)域,包括海洋、土壤、熱液口、熱泉、人體口腔及胃腸道，并在醫(yī)藥、替代能源、環(huán)境修復(fù)、生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)、生物防御及倫理學(xué)等各方面顯示出重要價(jià)值。在酶學(xué)開(kāi)展方面因組學(xué)顯示出強(qiáng)大的生命力，在發(fā)現(xiàn)新型酶以及有新型功能的酶方面已經(jīng)取得一些進(jìn)展23。應(yīng)用因組開(kāi)發(fā)新型酶?jìng)鹘y(tǒng)的新型酶的篩選方法大大限制了篩選的廣泛性和有效性24。因組學(xué)那么克制了這一限制，通過(guò)直接從環(huán)境中提取DNA樣品，盡可能為后面的篩選提供更加全面和多樣的基因資源，從而有效

14、地提高了新酶的篩選效率。一般來(lái)說(shuō)，新功能酶的篩選主要還是基于活性篩選。這種不依賴(lài)于序列的方法總體上可對(duì)所有新酶的活性或特異性進(jìn)展鑒定24。雖然，基于序列的篩選方法可能不像功能篩選那樣具有較強(qiáng)的目標(biāo)性但通過(guò)有目的地設(shè)計(jì)雜交探針或PCR引物,可一定程度地減少文庫(kù)的容量，縮小篩選的圍25。應(yīng)用因發(fā)現(xiàn)新基因由于自然界多數(shù)微生物物種及其生物量是未知的，其中存在大量不可培養(yǎng)的微生物，無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)法進(jìn)展研究，而因組學(xué)的策略那么突破了這一束縛。通過(guò)構(gòu)建因組文庫(kù)，而且從中鑒定出的大多數(shù)基因?qū)⒍际切碌幕?。應(yīng)用因篩選醫(yī)藥因組學(xué)在現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)中扮演著極其重要的角色，對(duì)因組文庫(kù)進(jìn)展功能篩選的重要目標(biāo)是篩選在醫(yī)藥業(yè)中具

15、有重要應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)物100如Doreen.E等26對(duì)土壤因組文庫(kù)進(jìn)展篩選，得到了2種新的抗生素TurbomycinA和B,這2種抗生素對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性微生物菌表現(xiàn)出廣譜的抗性。展望因組學(xué)研究將大大擴(kuò)展我們對(duì)生命的了解，包括了解生命如何耐受極端環(huán)境、新的生物能源、生命進(jìn)化以及微生物與環(huán)境之間的相互作用。因組技術(shù)通過(guò)對(duì)環(huán)境DNA的直接克隆,為研究和利用占微生物種類(lèi)99%以上的未可培養(yǎng)微生物提供了新的途徑。隨著新的科技方法的不斷開(kāi)展，因組的應(yīng)用圍將會(huì)越來(lái)越廣泛。參考文獻(xiàn)：1WhitmanWB,DCColeman,WJWiebe.Prokaryotes:TheunseenmajorityJ.P

16、rocNatlAcadSciUSA,1998,95(12):657826583.2AmannRI,BJBinder,RJOlsonetal1binationof16SrRNA2targetedoligonucleotideprobeswithflowcytometryforanalyzingmixedmicrobialpopulationsJ.ApplEnvironMicrobiol,1990,56(6):191921925.TorsvikV,OvreasL.Microbialdiversityandfunctioninsoil:fromgenestoecosystemsC.urrOpinMi

17、cobil,2002,5(3):240-245.RiesenfeldCSetal.AnnuRevGenet,2004,38:525-552CowanD,MeyerQ,StaffordW,etal.Metagenomicgenediscovery:past,presentandfutureJ.TrendsBiotechnol,2005,23(6):32329.叢延廣，胡福泉；因組學(xué):根本策略及在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的可能應(yīng)用；CHEMISTRYOFLIFE2007,27(1)；1000-1336(2007)01-0010-02美琴；JournalofAnhuiAgri.Sci.2021,36(2):4

18、15-416,479楚雍烈，娥；因組學(xué)及其技術(shù)的研究進(jìn)展；JournalofXianJiaotongUniversity(MedicalScience，s)Vol.29No.6Dec.2021蓉，胡永峰，金奇；因組學(xué)及其在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用；CHINESEJOURNALOFVIROLOGY，Vol.25No.3May2021馬莉莉，宗浩，宋培勇；因組學(xué)研究環(huán)境微生物的鑰匙；JournalofAnhuiAgr.iSc.i2021,37(20):9377-9379HenneA,RolfDaniel,RuthA.Schmitz,etal1ConstructionofEnvironmentalDN

19、ALibrariesinEscherichiacoliandScreeningforthePresenceofGenesConferringUtilizationof42HydroxybutyrateJ.ApplEnvironMicrobiol,1999,65(9):390123907.CourtoisS,MariaBallJLPernodet,etal1RebinantEnvironmentalLibrariesProvideAccesstoMicrobialDiversityforDrugDiscoveryfromNaturalProductsJ.ApplEnvironMicrobiol,

20、2003,69(1):49255.蘆曉飛，羅坤，丙炎，茆振川；因組學(xué)及其在植物病害生物防治中的應(yīng)用；ChineseJournalofBiologicalControl.2增刊6()106-112,Nov.202114GUNNARH,INGERO,RaknesaA,eta.lPreparativehighperformanceliquidchromatographicseparationandanalysisoftheMaltacineplexafamilyofcyclicpeptideantibioticsfromBacillussubtilisJ.JChromatogB,2004,811(2

21、):243251閻冰,洪葵,許云,等因組克隆!微生物活性物質(zhì)篩選的新途徑J微生物學(xué)通報(bào),2005,32(1):113117.DeLongEF,PrestonCM,MincerT,etalmunitygenomicsamongstratifiedmicrobialassemblagesintheoceansinteriorJScience,2006(311):496503.盛桂蓮,賴(lài)旭龍,侯新東.古DNA實(shí)驗(yàn)體系及技術(shù)J.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2021,25(2):116125SinghJ,BehalA,SinglaN,etal.Metagenomics;Concept,methodolo

22、gy,ecologicalinferenceandrecentadvancesJ.BiotechnolJ,2021,4(4):49840RichterM,LombardotT,KostadinovI,etal.JCoastAbiologistcentricsoftwaretoolfordataminingandparisonofprokaryotic(meta)genomesJ.BMCBioinformatics,2021,9(1):177185HusonDH,RichterDC,MitraS,etal.MethodsforparativemetagenomicsJ.BMCBioinformatics,2021,10(Suppl1):S12ZhouF,OlmanV,XuY.Barcodesforgenomesandapplic