DC細(xì)胞簡介課件

1、韓朝偉第1頁，共28頁。什么是DC形態(tài)與功能分化與成熟DC體外培養(yǎng)DC與腫瘤免疫DC-CIK對DC及腫瘤免疫的思考第2頁，共28頁。什么是DC樹突狀細(xì)胞（dendriticcells，DC）是目前所知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣突起而得名?？乖岢始?xì)胞（antigen-presentingcell，APC）是指能工加工、處理抗原并將抗原信息提呈給T淋巴細(xì)胞的一類細(xì)胞。在機(jī)體的免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。根據(jù)APC表面膜分子表達(dá)的特點(diǎn)和功能的差異，可將APC分為兩大類：專職性APC和非專職性APC，其中專職性APC包括樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞。而

2、非專職性APC抗原的處理和提呈功能較弱。第3頁，共28頁。DC的歷史抗原提呈細(xì)胞攝入抗原并將其加工處理，被主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）捕捉并以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式表達(dá)于細(xì)胞表面，是激活適應(yīng)性免疫的基礎(chǔ)，MHC分子在巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞上檢測到表達(dá)，因此它們曾被認(rèn)為是主要的抗原提呈細(xì)胞，但是Ralph Steinman的發(fā)現(xiàn)徹底顛覆了這一觀點(diǎn)。1973年至1980年，Steinman連續(xù)發(fā)表了一系列的論文，詳細(xì)報(bào)道了一類新的細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。第4頁，共28頁。該類細(xì)胞歸納起來具有以下特點(diǎn)：第一，該細(xì)胞存在于脾臟白髓質(zhì)，在外周淋巴結(jié)和

3、腸系淋巴結(jié)中均有發(fā)現(xiàn)；第二，該細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，體積比T/B淋巴細(xì)胞大，缺少溶酶體、高爾基體以及組織細(xì)胞具有的微絲管，最明顯的是細(xì)胞向四周伸出長短粗細(xì)不一的“偽足”；第三，該細(xì)胞不分裂，不具備胞吞的能力；第四，該細(xì)胞來源于骨髓而非胸腺，細(xì)胞表面高表達(dá)MHC分子；第五，該細(xì)胞能引起強(qiáng)烈的混合白細(xì)胞反應(yīng)，引起T細(xì)胞聚集，促進(jìn)T細(xì)胞活化與分裂，其效應(yīng)比巨噬細(xì)胞或B細(xì)胞高幾十甚至上百倍。根據(jù)這些特點(diǎn)，Steinman將這類細(xì)胞命名為樹突狀細(xì)胞（dendriticcell，DC）并推測可能與抗原提呈有關(guān)。第5頁，共28頁。Steinman的觀點(diǎn)最開始受到廣泛的質(zhì)疑，但Steinman頂住壓力堅(jiān)持了下來。

4、隨后的10年時(shí)間里，DC被許多其他的實(shí)驗(yàn)室觀察到，并被證實(shí)以未成熟DC或前體細(xì)胞的形式廣泛存在于各種組織和器官中，尤其在皮下、粘膜層以及血液中。這些細(xì)胞體積較小，缺少“偽足”，表達(dá)較低水平的MHC分子，較高水平的Fc受體和補(bǔ)體受體，具有強(qiáng)烈的吞噬能力，像“哨兵”一樣實(shí)時(shí)監(jiān)視著入侵宿主的病原微生物。一旦檢測到病原微生物，這些細(xì)胞立即啟動(dòng)吞噬和加工過程，大量合成MHC分子，趨化因子受體，輔助激活因子以及細(xì)胞因子，同時(shí)細(xì)胞啟動(dòng)成熟程序，體積增大，伸出“偽足”，遷移至淋巴結(jié)或脾臟，激活適應(yīng)性免疫。2019年，Steinman因在“樹狀細(xì)胞及其在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)方面作用的發(fā)現(xiàn)”，獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

5、第6頁，共28頁。形態(tài)與功能DC因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名第7頁，共28頁。第8頁，共28頁。功能最強(qiáng)的APCDC最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖，而巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞僅能刺激已活化的或記憶性T細(xì)胞，因此DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在免疫應(yīng)答的中具有獨(dú)特地位。DC對抗原和弱抗原都有很高的呈遞效率，只需少量的抗原及DC即可激活T細(xì)胞。未成熟的DC可能誘導(dǎo)免疫耐受，體外激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）的能力較弱，但具有極強(qiáng)的攝取和加工處理抗原的能力；成熟的DC能夠誘導(dǎo)免疫激活，其抗原提呈能力是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的1001000倍，同時(shí)激發(fā)MLR的能力很強(qiáng)，但抗原攝取能力大大下降。

6、第9頁，共28頁。未成熟DC具有極強(qiáng)的內(nèi)吞能力，通過膜皺縮和形成大囊泡，形成液相內(nèi)吞作用，可使極低濃度（1010mol/L）抗原得到呈遞，也可通過受體介導(dǎo)對糖基化抗原進(jìn)行內(nèi)吞。在與T細(xì)胞的互動(dòng)中，除提供MHC類分子/肽復(fù)合物的第一信號(hào)外，還高表達(dá)B7-1、B7-2、CD40分子，為T細(xì)胞提供充足第二信號(hào)，來促進(jìn)T細(xì)胞的激活。DC還可以增強(qiáng)體液免疫：一方面，DC通過促進(jìn)抗原特異性CD4+Th的產(chǎn)生，促進(jìn)抗體生成；另一方面，DC直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白的分泌。第10頁，共28頁。分化與成熟第11頁，共28頁。DC的產(chǎn)生分兩個(gè)階段：從祖細(xì)胞分化為未成熟DC和未成熟DC受外界刺激分化成熟。DC

7、的分化體內(nèi)DC起源于多能造血干細(xì)胞，按來源其分化途徑分為兩條：髓系分化途徑。稱為髓系DC，最終分化為朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)DC兩個(gè)亞群；淋巴系分化途徑。為淋巴系DC，最終分化為類漿細(xì)胞DC。髓系DC的分化發(fā)育分為4個(gè)階段：前體階段、未成熟DC、遷移期和成熟DC，不同分化階段的DC功能不同。DC前體經(jīng)血循環(huán)進(jìn)入非淋巴組織，分化為未成熟DC，未成熟DC具有很強(qiáng)的攝取、處理和加工抗原的能力。DC在攝取了抗原后遷移到次級淋巴組織，在此過程中DC也隨之成熟。第12頁，共28頁。正常情況下，體內(nèi)多數(shù)DC處于未成熟階段，其廣泛分布于全身各外周組織，高表達(dá)吞噬相關(guān)受體，而不表達(dá)或低表達(dá)共刺激分子和黏附分子。未成熟

8、DC有較強(qiáng)的抗原內(nèi)吞和加工處理能力，而激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力較弱。經(jīng)過抗原攝取、炎性因子活化等一系列過程，DC由未成熟轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒欤墒霥C則高表達(dá)MHC類分子、共刺激分子和黏附分子，CD83、CD25為成熟DC的特征性標(biāo)志。成熟DC的抗原呈遞能力及體外激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力強(qiáng)，而抗原攝取能力弱。DC的成熟過程同時(shí)伴有遷徙，在外周組織中攝取抗原后，通過延長樹突狀突起，改變趨化因子受體表達(dá)等方式進(jìn)入淋巴結(jié)及淋巴管中成熟，并激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。第13頁，共28頁。未成熟DC與成熟DC的比較未成熟DC和成熟DC在形態(tài)學(xué)、表型等方面都有很大的不同。形態(tài)學(xué)方面，未成熟DC呈葡萄串樣半貼壁生長，細(xì)胞表面褶

9、皺多，毛刺樣突起少；成熟的DC集落分散，懸浮生長，細(xì)胞邊緣有明顯的毛刺樣突起。表型方面，未成熟的DC僅表達(dá)低水平的MHC分子、協(xié)同刺激分子（CD80、CD86）和黏附分子（CD40、CD44、CD54）等；成熟DC則表達(dá)高水平的MHC分子、協(xié)同刺激分子和黏附分子、整合素（1、2）及特征性標(biāo)記（CDla、CD11c、CD83）等，并能分泌IL-12、IL-2l、IL-26、IL-28、腫瘤壞死因子-（TNF-）、IFN-等細(xì)胞因子。第14頁，共28頁。DC體外培養(yǎng)目前DC多來自骨髓或外周血CD34+造血祖細(xì)胞、外周血DC及單核細(xì)胞，其中以單核細(xì)胞來源的DC應(yīng)用最廣。獲取DC的方法有：將來源于骨髓

10、或外周血CD34+造血祖細(xì)胞在體外與GM-CSF和腫瘤壞死因子共同培養(yǎng)，獲得大量DC。單核細(xì)胞在GM-CSF和IL-4共同作用下誘導(dǎo)分化為未成熟DC，并在外來因素刺激下進(jìn)一步分化為成熟DC。Flt3配體能動(dòng)員DC進(jìn)入外周血，顯著增加外周血中DC的數(shù)量，進(jìn)而直接從外周血中分離純化到大量DC。第15頁，共28頁。單核細(xì)胞培養(yǎng)DC的過程1.PBMC的分離靜脈采血40ml，以2：1體積比加于用淋巴細(xì)胞分離液液面，離心分離PBMC，500g，20min。小心吸取富含單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞層，以1：5體積比，用RPM1-1640洗滌細(xì)胞三次：650g，10min；300g，10min兩次。2.MCM的制備IgG

11、包被培養(yǎng)皿：取6ml10mg/ml人IgG加入10cm的培養(yǎng)皿，靜置1h后吸盡液體，用RPMI-1640洗平板兩次。將上述方法分離所得PBMC5107/8ml，加入平板，37靜置2h，洗去非貼附細(xì)胞，再加入8mlRPMI-1640，37，培養(yǎng)24h。離心收集培養(yǎng)液，0.2m濾頭過濾，分裝，-20保存?zhèn)溆?，工作濃?5%。第16頁，共28頁。3.DC的培養(yǎng)用RPM1-1640重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1106/ml，加入12孔板，每孔4106，37靜置2h，輕輕吹打，懸浮非貼壁細(xì)胞，棄去。再用預(yù)熱的RPM1-1640輕洗培養(yǎng)板兩次，部分標(biāo)本用75cm2培養(yǎng)瓶過夜培養(yǎng)或4低溫培養(yǎng)液收集懸浮細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入

12、24孔板培養(yǎng)（間接貼壁）。加入含10%FCS完全培養(yǎng)基，2-巰基乙醇（濃度為510-5M），rhIL-4，rhGM-CSF各1000U/ml，37，5%CO2，培養(yǎng)57d收獲未成熟DC。部分培養(yǎng)自第7d始加入單核細(xì)胞條件性培養(yǎng)液（MCM）或TNF-（100Ug/ml）第1114d收獲成熟DC。第17頁，共28頁。DC與腫瘤免疫人體的抗腫瘤免疫流程：腫瘤相關(guān)抗原的攝取與呈遞；激活腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞；引導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞至腫瘤部位，殺滅腫瘤細(xì)胞。機(jī)體抗腫瘤免疫主要依靠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的免疫應(yīng)答來殺傷腫瘤細(xì)胞，CTL并不能識(shí)別完整的

13、腫瘤抗原分子，只能特異性地識(shí)別來源于腫瘤抗原親本、由MHC分子呈遞的抗原多肽。在大部分惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞表面的MHC抗原肽、共刺激分子和黏附分子表達(dá)較低，不能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，故需要抗原呈遞細(xì)胞的協(xié)同作用。第18頁，共28頁。DC可以通過多種機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤免疫作用。(1)激發(fā)細(xì)胞免疫。在腫瘤患者體內(nèi),DC可以直接向CD8+T細(xì)胞提呈腫瘤抗原,誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。(2)激發(fā)體液免疫。一方面,DC可以促進(jìn)抗原特異性CD4+輔助性T細(xì)胞(helperTcells,Th)的產(chǎn)生,啟動(dòng)CD4+Th11668相關(guān)免疫應(yīng)答;另一方面,DC還可直接作用于B細(xì)胞從而促進(jìn)免疫球蛋白的分泌。(3)自分泌或誘導(dǎo)其

14、他細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子或趨化因子。(4)DC可以與腫瘤細(xì)胞直接接觸而抑制其生長。(5)腫瘤抗原致敏的DC可釋放一種具有抗原提呈能力的囊泡小體,該小體內(nèi)含有大量MHCI、II類分子和共刺激分子,能顯著刺激抗原特異性CD8+T細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)。第19頁，共28頁。腫瘤微環(huán)境雖然DC有強(qiáng)大的抗腫瘤作用,但實(shí)際在患者體內(nèi)的效果卻不盡如人意,這可能與腫瘤的微環(huán)境誘導(dǎo)了免疫耐受的出現(xiàn)有關(guān)。腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了重要角色。由于腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞及其他間質(zhì)細(xì)胞相互作用,并產(chǎn)生多種免疫抑制性因子,從而營造了免疫抑制性腫瘤微環(huán)境,抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng),促使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫

15、監(jiān)控,最終導(dǎo)致腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境能夠影響DC的募集、分化、成熟和生存,抑制DC提呈抗原和激活T細(xì)胞,造成宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的無應(yīng)答從而發(fā)生免疫耐受。在這些機(jī)制中,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory Tcells,Treg)及JAK2/STAT3通路起到了重要作用。第20頁，共28頁。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫負(fù)調(diào)控功能的T細(xì)胞亞群，該類細(xì)胞通過細(xì)胞直接接觸和分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子發(fā)揮抑制效應(yīng)，逃避自身免疫反應(yīng)，從而使少量的惡變細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視和免疫防御，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯增多，而且CD4+CD25+細(xì)胞水平

16、越高，預(yù)后越差。CD8+CD28-T細(xì)胞是近年來被證實(shí)的另一種重要的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，這種T細(xì)胞在腫瘤患者的外周血中也大量增多，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，其具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，可抑制機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。然而，完全清除具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)引起各種嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)。因此，糾正患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境的免疫失衡，降低腫瘤患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，保持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，是治療腫瘤的關(guān)鍵之一。第21頁，共28頁。DC-CIKDC細(xì)胞可有效地誘導(dǎo)靜止T細(xì)胞增殖和應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞的生成，啟動(dòng)并參與免疫應(yīng)答。同時(shí)還是CD8+CTL和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的原發(fā)性和繼發(fā)性免疫反應(yīng)的最強(qiáng)的激發(fā)者，可

17、有效地抑制腫瘤逃逸。CIK細(xì)胞兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞MHC限制性殺瘤的特點(diǎn)，是一種體外增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高的廣譜抗瘤免疫活性細(xì)胞。在殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面有一定的效果，能一定程度上降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。CIK細(xì)胞雖然兼具腫瘤特異性及細(xì)胞毒活性，但其遠(yuǎn)期治療效果較弱，而DC則具有遠(yuǎn)期療效明顯的優(yōu)勢，故DC與CIK共培養(yǎng)后形成的DC-CIK既有CIK的非MHC限制性抗腫瘤作用，也有DC的MHC限制性細(xì)胞毒作用，提高了免疫殺傷特異性，實(shí)現(xiàn)了近期與遠(yuǎn)期效果并重的目的。第22頁，共28頁。DC-CIK的協(xié)同作用：成熟DC表面表達(dá)多種抗原遞呈分子、共刺激分子及細(xì)胞黏附分子，

18、有利于腫瘤抗原向CIK細(xì)胞的遞呈。而DC的抗原遞呈功能可增強(qiáng)CIK細(xì)胞分泌IFN-的能力，且分泌量大大增加。DC表面的CD40與CIK表面的CD40L結(jié)合，可活化DC表面分子及共刺激分子，增加DC分泌細(xì)胞因子，刺激CIK的增殖及成熟。CIK細(xì)胞與同源DC共培養(yǎng)后可大大促進(jìn)DC分泌IL-12，DC分泌的IL-2、IL-12等細(xì)胞因子又可促進(jìn)CIK細(xì)胞的增殖，IL-12可尤其促進(jìn)CD56+細(xì)胞的表達(dá)，增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺瘤活性，還可誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，幫助清除腫瘤細(xì)胞。DC-CIK共育后CD86、CD80、CD40、HLA-DR的含量增加，同時(shí)Treg及IL-10的表達(dá)降低，因而Treg對抗腫瘤細(xì)

19、胞的抑制作用被弱化。第23頁，共28頁。DC-CIK共培養(yǎng)1.采血約70-80ml，分離機(jī)分離出單個(gè)核細(xì)胞，用PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，離心、去上清，加入PBS混勻，離心，反復(fù)洗滌3次，除去血小板和分離介質(zhì)；將調(diào)整好的細(xì)胞液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶后立即放至37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，培養(yǎng)2h后可見兩種不同方式生長的細(xì)胞：貼壁生長和懸浮生長。貼壁生長的是DC細(xì)胞，懸浮生長的是CIK細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞收集至新的培養(yǎng)瓶，剩下的就是DC細(xì)胞。第24頁，共28頁。2.DC細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入10%自體血漿、重組人白介素-4，400U/ml、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子800U/ml在37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3、5天更換補(bǔ)充淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，第4天加入特異性腫瘤抗原負(fù)載，第5天加入腫瘤壞死因子500U/ml，誘導(dǎo)DC成熟，第7天收集DC細(xì)胞；3.CIK細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基、10%自體血漿，調(diào)整細(xì)胞濃度至（1.52.0）106/ml后加入重組人干擾素1000U/ml，在37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后加入白細(xì)胞介素-1100U/ml、白細(xì)胞介素-2，1000U/ml、抗人CD3單抗50ng/ml繼續(xù)培養(yǎng)，第3、5天更換補(bǔ)充淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基并加入10%自