甾體激素類藥物的分析

1、藥物(yow)分析學(xué)（第十五章）甾體激素類藥物(yow)的分析（2）本節(jié)教師： 韓海 （博士/副教授 )暨南大學(xué)藥學(xué)院Tel:-mail: QQ: 560118562013.11.11共九十三頁 第二節(jié) 鑒別(jinbi)實(shí)驗(yàn)1. 物理常數(shù)2.化學(xué)鑒別:母核和各種官能團(tuán)的反應(yīng)呈色反應(yīng)、官能團(tuán)反應(yīng)：沉淀(chndin)反應(yīng)、鹵素反應(yīng)3.制備衍生物測定熔點(diǎn)4. 紫外分光光度法5. 紅外分光光度法6.色譜法TLC、HPLC共九十三頁物理(wl)常數(shù)共九十三頁 呈色反應(yīng) （一）與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)（甾體母核）與硫酸、磷酸(ln sun)、高氯酸、鹽酸等呈色.硫酸呈色反應(yīng)應(yīng)用最廣1

2、)反應(yīng)顏色最豐富2)靈敏度較高可能機(jī)制為濃硫酸與甾體的酮基質(zhì)子化反應(yīng)，形成正碳離子，然后與HSO4-作用。共九十三頁與硫酸顯色反應(yīng) 顯 色 熒光 加水稀釋潑尼松龍 深紅 絮狀灰潑尼松 橙 黃藍(lán)綠炔雌醚 橙紅 黃綠 紅色 炔雌醇 橙紅 黃綠 絮狀玫紅醋酸可的松 黃或微 褪色并澄 帶橙 清共九十三頁特點(diǎn)：操作(cozu)簡便，反應(yīng)靈敏，通過形成的顏色或熒光的不同而互相區(qū)別，但操作(cozu)條件不易掌握。某些甾體激素藥物與硫酸乙醇或硫酸甲醇作用而呈色。如甲睪酮.雌性激素藥物常以硫酸乙醇的呈色反應(yīng)來鑒別.例: Chp中雌二醇鑒別取本品約2ml，加硫酸2ml溶解，有黃綠色熒光，加三氯化鐵試液2滴呈草綠

3、色，再加水稀釋，則變?yōu)榧t色。共九十三頁 （二）官能團(tuán)的呈色反應(yīng)利用官能團(tuán)的呈色反應(yīng)可區(qū)別不同的藥物(yow) 1.C17-醇酮基的呈色反應(yīng)C17-醇酮基有還原性，能與氧化劑四氮唑鹽反應(yīng)顯色。例:(Chp中醋酸潑尼松鑒別)醋酸潑尼松在堿性條件下與氯化三苯四氮唑試液反應(yīng)生成紅色。共九十三頁討論：1).本反應(yīng)亦可用于薄層色譜法鑒別甾體激素類藥物的顯色反應(yīng)。 （如醋酸潑尼松片及眼膏、醋酸氟氫可的松軟膏等）2).該呈色反應(yīng)不僅能用做皮質(zhì)激素類藥物的鑒別和檢查(“其他甾體”的檢查)，也是該類藥物含量測定的依據(jù)。3).C17-醇酮基還可以和斐林試液(sh y)、多倫試液(sh y)發(fā)生反應(yīng)。共九十三頁 2.

4、酮基的呈色反應(yīng)C3-酮基、C20-酮基能與2，4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼等羰基(tn j)試劑反應(yīng)形成黃色的腙。例如:氫化可的松，其乙醇溶液加新制的硫酸苯肼試液，加熱即顯黃色。 3.甲酮基以及活潑亞甲基能與亞硝鐵氰化鈉、間二硝基酚、芳香醛類反應(yīng)呈色。共九十三頁其中亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)是黃體酮的靈敏(ln mn)、專屬的鑒別方法。在一定的條件下，黃體酮顯藍(lán)紫色，其他常用甾體激素均不顯藍(lán)紫色，而呈現(xiàn)淡橙色或不顯色。 4.酚羥基的呈色反應(yīng)C3為酚羥基的雌激素，能與重氮磺酸反 應(yīng)生成紅色偶氮染料。JP(14)收載的苯甲酸雌二醇利用該法進(jìn)行鑒別。共九十三頁含炔基的甾體激素(j s)（如炔雌醇、炔諾酮

5、等）白色(bis)炔銀鹽沉淀硝酸銀5. 乙炔基沉淀反應(yīng)共九十三頁 6. 有機(jī)鹵素(l s)反應(yīng)有機(jī)(yuj)氟F有機(jī)破壞有機(jī)氯Cl 茜素氟藍(lán) 硝酸亞鈰硝酸硝酸銀AgCl 呈色 鹵素在母核上：氧瓶燃燒法破壞如地塞米松磷酸鈉鹵素在側(cè)鏈上：加熱水解法破壞如丙酸倍氯他索共九十三頁7.酯的反應(yīng)(fnyng)香C17或C21位羥基酯，應(yīng)先水解；再根據(jù)(gnj)羧酸的性質(zhì)鑒別。例：醋酸酯類藥物戊酸、己酸酯類藥物，有特臭。 共九十三頁制備(zhbi)衍生物測定其熔點(diǎn)原理1.甾醇、甾酮類藥物可與一些試劑反應(yīng)生成酯、肟、縮氨脲. 測定(cdng)其熔點(diǎn)進(jìn)行鑒別。2.利用醇制堿液水解甾體酯類生成相應(yīng)的母體，測定其熔

6、點(diǎn)進(jìn)行鑒別。特點(diǎn)繁瑣費(fèi)時，但專屬性強(qiáng).目前仍為一些國家藥典采用。共九十三頁炔雌醇m.p.201黃體酮雙肟m.p.238共九十三頁苯丙酸諾龍縮氨基脲m.p.178185分解丙酸睪丸素m.p.150156共九十三頁紫外分光(fn un)光度法原理：具有C=C-C=O共軛系統(tǒng)， -3-酮 240nm和C=C-C=C共軛系統(tǒng)，苯環(huán)(bn hun)（B帶：280nm，K帶：220nm ）1.可用規(guī)定波長處的吸收度鑒別如:曲安西龍2. 吸收度的比值法。如: 丙酸倍氯米松共九十三頁-3-酮 240nm共九十三頁 紅外分光(fn un)光度法必要性1.許多重要的甾體激素藥物(yow)紫外光譜非常相似，紫外光譜

7、鑒別缺乏專屬性。2.甾體激素藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)上僅有微小的差異，也難以用化學(xué)鑒別法來區(qū)分。共九十三頁紅外分光(fn un)光度法的優(yōu)勢1.對樣品無破壞, 樣品用量較少 2.特征性極強(qiáng)、 信息量豐富: 每種化合物都有紅外吸收，從紅外光譜可以得到大量信息。官能團(tuán)區(qū)的吸收反映(fnyng)了化合物中官能團(tuán)的特征，而指紋區(qū)的吸收對于指認(rèn)分子提供了可靠的依據(jù)。共九十三頁紅外分光(fn un)光度法的應(yīng)用各國藥典幾乎均采用紅外分光光度法鑒別甾體激素原料(yunlio)藥物，中國藥典中36種甾體激素原料(yunlio)藥物，其中33種采用該方法鑒別！鑒別方法:按規(guī)定錄制紅外光譜圖，要求供試品光譜圖與對照品光譜圖一

8、致。共九十三頁甾體激素藥物(yow)的紅外光譜特征紅外光譜主要反映了化合物中官能團(tuán)的特征.甾體藥物中有那些紅外活性基團(tuán)(j tun)?1.基本骨架：大量的CH3、CH2、CH基團(tuán)共九十三頁. C-H 15001300 cm-1CH3 2962 cm-1，反對稱伸縮(shn su)振動 2872 cm-1 ，對稱(duchn)伸縮振動 CH2 2926 cm-1，反對稱伸縮振動 2853 cm-1 ，對稱伸縮振動 29702850cm-11375 cm-1處的吸收分叉，等高1460，1375 cm-1同時有吸收伸縮振動彎曲振動共九十三頁2.此類藥物大部分含有C=C雙鍵CH伸縮振動頻率大于3000

9、cm-1（峰尖、弱）大約3040 3010cm-1 CC伸縮振動頻率在16201585cm-1, （峰尖、中等）CH（面外彎曲(wnq)振動頻率）與雙鍵上氫的數(shù)目，即取代情況有關(guān)。共九十三頁3.此類藥物大部分含有羰基(tn j)羰基峰極強(qiáng), 鑒別價值大. C=O 六員環(huán) 17201705cm-1 C=O 五員環(huán) 17491742cm-1 C=O C20 17101706cm-1 C=O 4 3 酮16841620cm-14.此類藥物還可能含有羥基、醚鍵等特征結(jié)構(gòu)。共九十三頁甾體激素(j s)藥物某些基團(tuán)的紅外特征頻率見書292-293頁表10-3炔雌醇的紅外吸收光譜(x shu un p)結(jié)構(gòu)

10、特征：苯環(huán)、酚羥基、C17 OH C17 乙炔基共九十三頁1505cm-13505cm -13300cm-11590cm-13610cm-1酚羥基(qingj)醇羥基(qingj)1616cm-1苯環(huán)的骨架振動亞甲基、角甲基吸收帶CH苯環(huán)指紋區(qū)共九十三頁黃體酮共九十三頁薄層(bo cn)色譜法特點(diǎn)：簡便、快速、分離效能高。主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別ChP很多甾體激素制劑均用該法鑒別。應(yīng)用范圍：甾體激素制劑的鑒別、純度檢查以及含量測定(cdng)前的分離和制劑穩(wěn)定性的研究。共九十三頁方法：對照品法 1.供試品點(diǎn)樣通常需做前處理（如有機(jī)溶劑提?。?，消除(xioch)注射液、片劑及軟膏劑等輔料

11、的干擾。 2.要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對照品溶液的主斑點(diǎn)相同。顯色方法：多用熒光顯色法或熒光淬滅法熒光顯色共九十三頁高效(o xio)液相色譜法主要(zhyo)用于甾體激素類藥物制劑的鑒別方法：對照品法一般在含量測定的同時進(jìn)行鑒別. 要求在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對照品峰的tR一致。共九十三頁第三節(jié)、特殊雜質(zhì)(zzh)檢查必要性：甾體激素藥物多由結(jié)構(gòu)改造來，可能帶來原料、中間體、異構(gòu)體、降解(jin ji)產(chǎn)物以及試劑、溶劑等。藥典規(guī)定檢查的重要項(xiàng)目有： （一）其他甾體（二）硒（三）有機(jī)溶劑殘留量 （四）游離磷酸鹽 此外，有些甾體藥物還規(guī)定其他檢查項(xiàng)目。共九十

12、三頁Li/NH3 C2H5OH（可能(knng)殘留）弱酸(ru sun)雌二醇3甲醚（可能殘留）苯丙酸諾龍的合成路線I（可能殘留）II（可能殘留）共九十三頁強(qiáng)酸（可能(knng)殘留）苯丙酰氯（可能(knng)殘留）HClIII（可能殘留）苯丙酸諾龍的合成路線II共九十三頁（一）其他(qt)甾體 定義：藥物中存在的具有甾體結(jié)構(gòu)且與標(biāo)示藥物結(jié)構(gòu)不同的其他化合物都稱為 “其他甾體”。 具有互相(h xing)不同的藥理作用！ 有必要檢查來源：原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物特點(diǎn)：（1）可能存在多個甾體雜質(zhì) （2）結(jié)構(gòu)類似，多數(shù)為未知物質(zhì)分析方法必須具有一定分離能力共九十三頁其他(qt)甾體檢查法

13、（一）TLC檢查法（高低濃度對比法）使用最為普遍的甾體特殊雜質(zhì)檢查法采用供試品的稀釋溶液做對照，以對照溶液(rngy)斑點(diǎn)顏色為參比來控制雜質(zhì)限量。中國藥典2005版36種甾體激素原料藥物，其中33種采用該方法檢查特殊雜質(zhì)！例：教材294頁醋酸潑尼松、炔雌醇的雜質(zhì)檢查 共九十三頁 33種甾體激素(j s)藥物TLC色譜條件的特點(diǎn)總結(jié)： 1.薄層板：大多采用硅膠G板，少數(shù)采用硅膠GF254或硅膠HF254。 2.溶劑: 氯仿-甲醇/甲醇/氯仿/丙酮 3.展開劑系統(tǒng)：首選不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶劑。（其他：苯/無水乙醇/二氯甲烷-甲醇-水/氯仿-甲醇等） 4.顯色劑：首選堿性四氮唑

14、藍(lán)試液。 （其他：硫酸-乙醇/濃硫酸/10%磷鉬酸-乙醇） 5.檢測法：紫外燈(254nm/365nm)/日光檢視。共九十三頁TLC判定(pndng)方法 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色 供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，不得多于XX個，其顏色與對照液的主斑點(diǎn)比較(bjio)，不得更深。 高低濃度對比法雌二醇雜質(zhì)檢查TLC圖共九十三頁特點(diǎn)(tdin)： （1）簡便易行，不需特殊的儀器； （2）不需對照品；（3）要求雜質(zhì)斑點(diǎn)與主成分斑點(diǎn)的顏色相近且顯色(xin s)靈敏度也接近。（4）不能控制全部雜質(zhì)的限量；也不能控制雜質(zhì)的總量自身對照共九十三頁（二）HPLC法方法：1.自身對照法（加/不加校正因子）

15、采用供試品的稀釋溶液做對照，以對照溶液(rngy)主峰面積為參比來控制雜質(zhì)限量。例：教材295頁黃體酮雜質(zhì)檢查為不加校正因子的自身對照法。 2.主成分歸一化法（HPLC-UV法檢測靈敏度較低時）共九十三頁對照溶液0.02mg/ml供試液1 mg/ml黃體酮中有關(guān)(yugun)物質(zhì)檢查供試品溶液的雜質(zhì)(zzh)峰數(shù)不得超過1個，其面積不得大于對照液的主峰面積的3/4共九十三頁甾體激素藥物HPLC色譜條件的特點(diǎn)總結(jié)：1.色譜柱：十八烷基硅烷鍵和硅膠。 2.流動相：各種不同比例的甲醇(ji chn)-水混合溶劑。 3.檢測器：紫外（214nm/254nm/281nm，230nm/288nm） 4.判

16、定方法:規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)峰面積共九十三頁HPLC法進(jìn)行藥物特殊雜質(zhì)(zzh)檢查的特點(diǎn) （1）需特殊的儀器； （2）不需對照品； （3）可以控制雜質(zhì)(zzh)的總量； （4）雜質(zhì)與主成分測定的靈敏度可以不同。（用校正因子消除）共九十三頁（二）硒的檢查(jinch)來源 合成(hchng)中用二氧化硒(SeO2)脫氫原理方法劇毒含硒物質(zhì)限量0.01%共九十三頁（三）有機(jī)殘留(cnli)溶劑的檢查必要性：甾體激素藥物在生產(chǎn)工藝中使用大量有機(jī)溶劑。（特別(tbi)是甲醇和丙酮）測定法：GC法示例 ：地塞米松磷酸鈉有機(jī)殘留溶劑的檢查方法。（教材396頁）共九十三頁判定(pndng)標(biāo)準(zhǔn)1.甲醇

17、 不得超過0.3%（g/g） 2.丙酮 不得超過0.5%（g/g） 內(nèi)標(biāo)法 + 校正因子定量!限量確定的原則藥品注冊的國際技術(shù)要求（ICH）規(guī)定 甲醇第二類毒性溶劑(rngj)限量100） UV法含量測定與羰基試劑（異煙肼）反應(yīng) 異煙肼比色法2. C17 醇酮基（皮質(zhì)激素）還原性 與氧化劑四氮唑鹽反應(yīng)顯色 四氮唑比色法共九十三頁3.甾體母核（特別是雌激素母核）可以以強(qiáng)酸的呈色 Kober反應(yīng)比色法甾類藥物(yow)含量測定方法有：1.反應(yīng)比色法（異煙肼比色法、四氮唑比色法、Kober反應(yīng)比色法）2.紫外分光光度法3.高效液相色譜法4.柱前衍生化氣相色譜法、GC-MS法5.放射免疫分析法（FIA

18、），ELISA技術(shù)共九十三頁一、高效(o xio)液相色譜法必要性：甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)的比色法有干擾。優(yōu)點(diǎn)：用樣量少，靈敏度高，分離效果好，專屬性強(qiáng) ChP中：89種甾體激素原料和制劑，有43種采用(ciyng)RP-HPLC法（一般用內(nèi)標(biāo)法）含量測定，占該類藥物含量測定方法的48%，居首位。共九十三頁實(shí)例：教材397頁特點(diǎn)總結(jié)(zngji)：1.分離模式: 反相分配色譜2.固定相: 十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)3.流動相: 甲醇和水的混合液 (個別采用甲醇水乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氫呋喃-水等溶劑系統(tǒng)，有時在流動相中加入醋酸鹽緩沖液或磷酸

19、鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值）4.紫外直接檢測: (240nm或280nm附近)43酮基和苯環(huán)共九十三頁二、紫外分光(fn un)光度法1.皮質(zhì)激素、雄性激素、孕激素4-3-酮基（C=C-C=O）共軛系統(tǒng)(xtng)max=240nm 2. 雌激素（具有苯環(huán)）苯環(huán)（C=C-C=C）共軛系統(tǒng)，max=280nm（此吸收較弱）共九十三頁UV醋酸地塞米松共九十三頁優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、簡便，被廣泛用于原料和制劑的分析。原料、注射液稀釋(xsh)成一定濃度后即可直接測定。但在片劑分析時需要預(yù)處理排除干擾。 （賦形劑在240nm附近有吸收，需先用一定溶劑提取、濾過。）Chp中收載的89種甾體激素原料和制劑25種用該法測定含

20、量，占本類藥物分析的28%，僅次于HPLC，居第二位。但現(xiàn)在正在被HPLC取代中！共九十三頁實(shí)例(shl)1.原料藥:教材398頁: 炔雌醚2.片劑:教材398頁: 醋酸(c sun)潑尼松龍片賦形劑在240nm附近有吸收，需先用乙醇提取、濾過。計(jì)算共九十三頁 三、反應(yīng)(fnyng)比色法方法(fngf)介紹:比色法: 直接比色法光度活性藥物 反應(yīng)比色法非光度活性藥物弱、非光度活性藥物強(qiáng)光度活性藥物化學(xué)反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：1. 適用于非光度活性藥物2. 使待測組光譜位移，避免干擾，增加選擇性3. 增加測定靈敏度共九十三頁甾體激素(j s)的反應(yīng)比色法異煙肼比色法、四氮唑比色法、Kober反應(yīng)(fnyng

21、)比色法（一）、異煙肼比色法原理：HCl（縮合）在一定波長下具有最大吸收共九十三頁 四氮唑比色法 基本原理：腎上腺皮質(zhì)激素類C17-醇酮基具有還原性，在強(qiáng)堿性溶液中能將四氮唑鹽定量(dngling)地還原為有色甲 多為紅色或藍(lán)色。 formazan在一定波長處進(jìn)行比色測定。 OH -還原共九十三頁反應(yīng)(fnyng)機(jī)理C17-醇酮基失去2個電子氧化為20-酮基-21醛基，在堿催化下，分子內(nèi)部(nib)重排。而四氮唑鹽得到2個電子，開環(huán)形成甲而顯色。共九十三頁四氮唑鹽的種類(zhngli)1.氯化三苯四氮唑2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chl

22、orid，TTC）其還原(hun yun)產(chǎn)物為不溶于水的深紅色三苯甲(max:480490nm) 紅四氮唑（red tetrazoline，RT）。共九十三頁2.藍(lán)四氮唑（blue tetrazoline，BT），即3，3-二甲氧苯基-雙-4，4-（3，5-二苯基）氯化四氮唑3，3-dianisole-bis4，4-（3，5-diphenyl）tetrazolium chloride其還原(hun yun)產(chǎn)物為暗藍(lán)色的雙甲 ，max525nm。共九十三頁測定方法對照(duzho)品法ChP TTC（RT） BP TTC（RT）USP BT4045暗共九十三頁實(shí)例：醋酸(c sun)地塞米松

23、磷酸鈉含量測定ChP方法供試液：精密量取本品5 mL （約醋酸地塞米松25 mg），置100mL量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解(rngji)，并稀釋至刻度，搖勻。濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。 對照液：精密稱取醋酸地塞米松磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置100mL量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。共九十三頁測定法：精密量取上述溶液各1 mL，分別置干燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9 mL與氯化三苯四氮唑試液1 mL，搖勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液1 mL，搖勻，在25暗處放置(fngzh)4050分鐘，照分光光度法，在485 nm的波長處分別測定吸收度，計(jì)算。操作應(yīng)避光。水分影響(y

24、ngxing)反應(yīng)速度制造強(qiáng)堿性環(huán)境反應(yīng)過程、反應(yīng)產(chǎn)物怕光共九十三頁討論(toln)各種因素的影響1.基團(tuán)(j tun)的影響：C11= O C11OHC21OH C21-酯C16無論何種取代基2. 溶劑、水分的影響含水量5%含水10%A10%含水30%幾無反應(yīng) 無水乙醇醛 A 無醛無水乙醇共九十三頁3.堿的種類和加入順序(shnx)的影響：反應(yīng)應(yīng)在強(qiáng)堿性（pH13.75）條件下進(jìn)行以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳. 皮質(zhì)激素和氫氧化四甲基銨長時間（24h）接觸后，部分分解.加入順序：共九十三頁4. O2與光線(gungxin)的影響反應(yīng)過程(guchng)反應(yīng)產(chǎn)物怕光避光、快速O2影響顏色強(qiáng)度和穩(wěn)

25、定性隔絕空氣、 快速、充N2共九十三頁5. 溫度與時間(shjin)t但t 甲 分解%一般以室溫或30恒溫條件下顯色，易得重現(xiàn)性較好的結(jié)果。ChP 25 4045BP 30 1h共九十三頁特點(diǎn)(tdin)：缺點(diǎn) 影響因素太多，操作(cozu)不易掌握。優(yōu)點(diǎn) 專屬性很好。意義：測定結(jié)果能指示藥品的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無此反應(yīng)） 廣泛應(yīng)用于皮質(zhì)激素的穩(wěn)定性研究。共九十三頁異煙肼比色法反應(yīng)式：具有兩個酮基的甾體激素黃體酮、氫化可的松可形成雙腙。方法：對照品法：暗45共九十三頁實(shí)例(shl)：ChP：倍他米松倍他米松磷酸鈉共九十三頁倍他米松共九十三頁討論(toln)1.溶劑選擇：無水乙醇和無水甲醇好

26、，其他(qt)溶劑受異煙肼鹽酸鹽溶解度影響不宜采用。甲醇穩(wěn)定性較好，呈色強(qiáng)度較高。但對植物油溶解度小。一般采用無水乙醇作為整個反應(yīng)的介質(zhì)。（倍他米松、倍他米松磷酸鈉等）共九十三頁2.酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：酸與異煙肼試劑的摩爾比為2:1時可獲得最大吸收度。酸度異煙肼鹽酸度 A試液(sh y)配制:取異煙肼75mg，加鹽酸0.1m1加甲醇使溶解成100ml。鹽酸：0.0074mol/L（硫酸(li sun)：0.0037mol/L 醋酸：4.4mol/L）異煙肼：0.00365mol/L 共九十三頁3.水分、O2與光線的影響(1)水分增高吸收(xshu)度降低，縮合物水解；可逆反應(yīng):含水

27、量腙水解A%故儀器及試劑應(yīng)盡量避免水分(2)溫度升高，反應(yīng)加速。(3)在不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時，光與氧不影響反應(yīng)。（具塞容器）共九十三頁4.反應(yīng)(fnyng)的專屬性：反應(yīng)速度C3 = O C17= O 、 C20= O C11= O 不反應(yīng)室溫(sh wn)不到1h即可定量地與酸性異煙肼反應(yīng)長時間放置或加熱后方可反應(yīng)完全本法對4-3-酮基甾體具有一定的專屬性。共九十三頁KOBER反應(yīng)(fnyng)比色法定義：指雌激素與硫酸(li sun)-乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸(li sun)稀釋后重新加熱發(fā)生顏色改變，并在515nm附近有最大吸收。原理：（兩步反應(yīng)）max=465max=515共九十

28、三頁實(shí)線第一步反應(yīng)(fnyng)虛線第二步反應(yīng)(fnyng)共九十三頁可能原理（了解）通過去羥基、重排及甲基由C13移到C17；然后被硫酸氧化形成具有較長共軛雙鍵發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)物 又進(jìn)一步生成(shn chn)具有吸收光譜紅移發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)物。max=515nm共九十三頁實(shí)例(shl)ChP 復(fù)方炔諾酮滴丸中炔雌醇片的含量(hnling)測定方法教材402頁缺點(diǎn)：1.第二步反應(yīng)難以徹底進(jìn)行，會出現(xiàn)雙色。 2. 輔料，賦形劑干擾測定改進(jìn)鐵酚試劑法共九十三頁五、體內(nèi)甾體激素類藥物分析(fnx)（了解）四、非水滴定米非司酮Doping control濫用藥物檢測刺激劑麻醉劑-阻斷劑利尿劑遮蔽(zhb)劑合成

29、類固醇及2激動劑肽類激素外源性內(nèi)源性共九十三頁1、甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應(yīng)(fnyng)的基團(tuán) A. 酚羥基 B. 活潑次甲基 C. 甲酮基 D. C17 -醇酮基 E. 酮基共九十三頁2、用異煙肼比色法測定甾體激素(j s)藥物含量時，其溶液的環(huán)境是 A酸性 B中性 C強(qiáng)堿性 D弱堿性 E以上都不對共九十三頁3、可用于氫化可的松鑒別(jinbi)的試劑有 A氨制硝酸銀 B異煙肼 C紅四氮唑 D濃硫酸 E重氮苯磺酸共九十三頁4、可用于甾體激體類藥物的測定方 法有 A高效液相色譜法 B四氮唑鹽法(yn f) C紫外分光光度法 D異煙肼比色法 EKober反應(yīng)比色法共九十三頁5、能與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)生成(shn chn)蘭紫色的藥物是 A雌二醇 B黃體酮 C醋酸可的松 D苯丙酸諾龍 E以上都不對共九十三頁6、各國藥典對甾體激素類藥物常用HPLC或GC法測定其含量，主要(zhyo)原因是A. 它們沒有特征紫外吸收，不能用紫外分光光度法B. 由于“有關(guān)物質(zhì)”的存在，色譜法可消除它們的干擾C. 色譜法比較簡單，精密度好D. 色譜法準(zhǔn)確度優(yōu)于滴定分析法共九十