微生物實(shí)驗(yàn)課件：實(shí)驗(yàn)六 抗菌藥物敏感試驗(yàn)（二）-常量肉湯稀釋法

1、實(shí)驗(yàn)六：抗菌藥物敏感試驗(yàn)（二）常量肉湯稀釋法一、目的與要求1.熟悉常量（宏量）肉湯稀釋法（macrodilution test）的原理、操作方法、結(jié)果判讀和臨床意義。2.了解常量肉湯稀釋法的注意事項(xiàng)。二、器材和抗菌藥物1.菌株 待測(cè)的大腸埃希菌2.抗菌藥物 慶大霉素原液（4000g/ml）。3.實(shí)驗(yàn)器材 無(wú)菌生理鹽水、接種環(huán)、無(wú)菌試管、無(wú)菌移液管、洗耳球等。4.培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯（以水解酪蛋白胨肉湯最好）。三、步驟和方法1.原理 用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，將抗菌藥物作不同濃度的倍比稀釋?zhuān)缓蠼臃N待測(cè)菌，定量測(cè)定抗菌藥物抑制該菌生長(zhǎng)的最低濃度（minimal inhibitory concentratio

2、n，MIC）。2.方法1）排列試管：排列15支試管于試管架上，除第一支外（抗菌藥物原液4ml），每管加入營(yíng)養(yǎng)肉湯2ml。2）慶大霉素的倍比稀釋?zhuān)簭牡?管中用無(wú)菌移液管吸取慶大霉素原液2ml于第2支試管中，混勻后從第2支試管中吸取2ml液體于第3支試管中，依次類(lèi)推至第14支試管混勻后，吸取2ml液體棄去，第15管不加抗菌藥物。這樣抗菌藥物的最終濃度含量依次為：4000、2000、1000、500、250、125、62、31、15、7.5、3.8、1.9、0.95、0.48g/ml。3）待測(cè)菌株的稀釋?zhuān)簩⒋郎y(cè)的大腸埃希菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝缓筮M(jìn)行1:100稀釋相當(dāng)于1.5106cfu/ml濃度的菌懸

3、液。稀釋完以后最好15min內(nèi)接種。4）加菌懸液：從第2支至第15支試管，每一支試管中加入0.1ml的菌懸液，混勻后，置35培養(yǎng)1824h后觀察結(jié)果。第1支試管不加菌懸液作為不生長(zhǎng)對(duì)照（陰性對(duì)照），而第15支試管不加抗菌藥物作為生長(zhǎng)對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照）。3.結(jié)果判別 以無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的抗菌藥物的最低濃度即為該抗菌藥物對(duì)待測(cè)菌最低抑菌濃度（MIC）。（培養(yǎng)基清晰無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)）記錄為：慶大霉素對(duì)該大腸埃希菌的最小抑菌濃度MIC為：1.9 g/mlMIC法操作步驟 試管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 營(yíng)養(yǎng)肉湯 (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

4、 2 2 2 2 抗菌藥物(ml) 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 棄去菌懸液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1抗菌藥物濃度4000 2000 1000 500 250 125 62 31 15 7.5 3.8 1.9 0.95 0.48（g/ml） 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 清 清 清 清 清 清 清 清 清 清 清 清 渾 渾 渾以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)管為最低抑菌濃度（MIC）結(jié)果報(bào)告： MIC （g/ml ）四、影響結(jié)果的因素1.培養(yǎng)基的pH、抗菌藥物的質(zhì)量、接種細(xì)菌的濃度、孵育的溫度和時(shí)間、無(wú)菌操作等均對(duì)結(jié)果觀察有影響。2.同時(shí)用質(zhì)控菌株做平行試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程每一個(gè)環(huán)節(jié)。五 、注意事項(xiàng) 1.在讀取和報(bào)告所測(cè)試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長(zhǎng)對(duì)照管的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。2.如果出現(xiàn)跳管現(xiàn)象（在連續(xù)幾支清晰的無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)管的中間出現(xiàn)12支有細(xì)菌生長(zhǎng)的渾濁培養(yǎng)管或在連續(xù)幾支有細(xì)菌生長(zhǎng)的渾濁培養(yǎng)管中間出現(xiàn)12支無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)管），應(yīng)檢查：培養(yǎng)物純度、操作過(guò)程中的其他細(xì)菌污染、加待測(cè)菌懸液的量、倍比稀釋的操作等因素，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。六、臨床意義1.可以測(cè)定某種抗菌藥物最小抑菌濃度（MIC）2.對(duì)于K