臨床血液學(xué)檢驗(yàn)第5講骨髓活檢及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、第一節(jié) 骨髓象檢驗(yàn)與分析第二節(jié) 細(xì)胞化學(xué)染色第三節(jié) 骨髓活體組織檢查第四節(jié) 造血細(xì)胞培養(yǎng)第五節(jié) 血細(xì)胞染色體檢驗(yàn)第六節(jié) 血液分子生物學(xué)檢驗(yàn) 第七節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)第四章 造血檢驗(yàn)的基本方法第三節(jié) 骨髓活體組織檢查一、骨髓活檢 取一塊骨髓活組織作切片，進(jìn)行病理細(xì)胞學(xué)觀(guān)察，了解骨髓組織結(jié)構(gòu)，和涂片互為補(bǔ)充和配合。二、適應(yīng)證：反復(fù)多部位干抽或稀釋致骨髓穿刺失敗全血細(xì)胞減少，骨髓增生低下，懷疑再障和有病態(tài)造血者涂片不能解決的不明原因貧血、發(fā)燒、肝脾淋巴結(jié)腫大。白血病治療效果的觀(guān)察：可觀(guān)察到原始細(xì)胞簇骨髓組織切片三、正常骨髓的組織細(xì)胞定位1.粒系細(xì)胞主要位于遠(yuǎn)離靜脈竇之造血索狀組織深部。原粒與早幼粒細(xì)胞常單

2、個(gè)地分布于骨小梁旁以及小動(dòng)脈和微動(dòng)脈四周。較成熟的粒細(xì)胞定位于小梁間區(qū)，至晚幼粒以下逐漸向靜脈竇竇壁移動(dòng)，最后通過(guò)竇壁孔隙釋放入血循環(huán)。2.紅細(xì)胞島常定位于小梁間區(qū)內(nèi)靜脈竇竇壁四周，內(nèi)層的幼紅細(xì)胞往往比外層更為幼稚。3.巨核細(xì)胞一般聚集于靜脈竇竇壁外，少數(shù)散在分布于全骨髓切片的不同部位，成熟巨核細(xì)胞通過(guò)竇壁內(nèi)皮間的小孔隙釋放血小板。4.淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞常定位于造血組織小動(dòng)脈的四周。 四、骨髓活體檢查的意義1.確切了解骨髓增生程度，協(xié)助血液病的診斷 造血組織面積脂肪組織面積 纖維組織面積2.可發(fā)現(xiàn)穿刺涂片不易發(fā)現(xiàn)的病理變化 低增生白血病，腫瘤浸潤(rùn)，解決干抽和稀釋問(wèn)題3.早期診斷和判定預(yù)后 MD

3、S的ALIP（abnormal localization of immature precursor)現(xiàn)象: 35個(gè)以上原粒與早幼粒細(xì)胞聚集成簇，位于小梁間區(qū)或小梁旁區(qū)轉(zhuǎn)移癌，惡性組織細(xì)胞病陽(yáng)性率高 4.協(xié)助診斷慢性骨髓增殖性疾病涂片難發(fā)現(xiàn) 包括骨髓纖維化、真性紅細(xì)胞增多，原發(fā)性血小板增多五、骨髓穿刺與活檢的比較穿刺活檢優(yōu)點(diǎn)抽取骨髓液涂片，W-G染色活檢針取一塊骨髓組織、固定、包埋、切片、染色1.操作簡(jiǎn)便1.保持造血組織結(jié)構(gòu)，便于判斷造血組織和脂肪組織面積2.細(xì)胞分布均勻，胞體舒展，細(xì)微結(jié)構(gòu)清晰，易識(shí)別2.判斷增生度準(zhǔn)確3.易識(shí)別巨型變、巨樣變和小巨核細(xì)胞3.避免稀釋4.細(xì)胞化學(xué)染色效果好，可

4、量化4.特殊疾病有確診價(jià)值、可細(xì)胞定位、干抽的鑒別缺點(diǎn)1.組織結(jié)構(gòu)已破壞1.細(xì)胞聚集，類(lèi)型不易區(qū)分2.易稀釋2.細(xì)微結(jié)構(gòu)不能觀(guān)察3.對(duì)干抽無(wú)法分析第四節(jié) 造血細(xì)胞培養(yǎng)1.干/祖細(xì)胞培養(yǎng)紅系祖細(xì)胞培養(yǎng)粒-單系祖細(xì)胞培養(yǎng)巨核系祖細(xì)胞培養(yǎng)混合祖細(xì)胞培養(yǎng)研究造血細(xì)胞分化、發(fā)育、調(diào)節(jié)，藥物影響，發(fā)病機(jī)制，治療效果分析2.白血病細(xì)胞系傳代培養(yǎng)名稱(chēng)類(lèi)型培養(yǎng)條件THP-1急性單核細(xì)胞白血病( FAB-M5)高糖DMEM培養(yǎng)基，含15%胎牛血清、10mM HEPES、1.0mM 丙酮酸鈉、0.05M 2-巰基乙醇、100U/ml青鏈霉素HL-60急性早幼粒細(xì)胞白血病(FAB-M3) RPMI-1640培養(yǎng)基，含

5、10%胎牛血清、100U/ml青霉素及鏈霉素K562慢粒急性變白血病Dami急性巨核細(xì)胞白血病( FAB-M7)Meg-01急性巨核細(xì)胞白血病( FAB-M7)高糖DMEM培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、100U/ ml青霉素及鏈霉素。 3.培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：RPMI1640，MEM，TC199溫度：37濕度：飽和5%CO2：提供碳源和調(diào)節(jié)酸堿度生長(zhǎng)因子：胎（?。┡Ｑ宓谖骞?jié) 血液細(xì)胞染色體檢驗(yàn)一、染色體結(jié)構(gòu)二、顯帶G帶R帶高分辨率帶染色體顯帶三、血液病常見(jiàn)染色體改變1.慢性粒細(xì)胞白血病8590的慢?；颊哂衪（9；22）異常，即Ph染色體。慢粒慢性期約1520病人伴有其他附加染色體變化，且在急變期其

6、發(fā)生率可明顯增高。附加變化多為：8，i（17 q）或19。Ph染色體的有無(wú)可將慢粒分為Ph陽(yáng)性與陰性?xún)深?lèi)，前者慢性期較長(zhǎng)，發(fā)生急變時(shí)間晚，后者反之。染色體的異常圖解 易位使9號(hào)染色體長(zhǎng)臂（9q34）上的原癌基因c- abl和22號(hào)染色體(22q11)上的bcr(break point cluster region)基因重新組合成融合基因。Ph染色體致病的分子機(jī)制：Igc-ablc-cis融合基因bcr9c-ablIgbcrc-cis222.急性非淋巴細(xì)胞白血病 染色體異常出現(xiàn)的亞型預(yù)后價(jià)值t（8；21）M2預(yù)后較好t（15；17）M3預(yù)后較好Inv（16），del（16q）M4Eo預(yù)后較好+8

7、各種亞型預(yù)后不良+21M1，M7+13雙表型預(yù)后不良5q，5，7繼發(fā)性白血病預(yù)后不良t（v；11）*M4，M5a預(yù)后不良t（8；16）M5b預(yù)后不良t（9；22）M1等預(yù)后不良t（4；11）雙表型預(yù)后不良3.急性淋巴細(xì)胞白血病 染色體異常出現(xiàn)的亞型預(yù)后價(jià)值t（4；11）L2預(yù)后不良t（1；9）L1預(yù)后較好t（8；14）L3（包括B、T細(xì)胞型）預(yù)后不良t（2；8）L3（成熟B細(xì)胞型）t（8；22）L3（成熟B細(xì)胞型）t（1；19）前B細(xì)胞型預(yù)后不良超二倍體L1，L2預(yù)后良好t（9；22）L1，L2預(yù)后不良t（10；14）T細(xì)胞型t（7；14）T細(xì)胞型t（7；7）T細(xì)胞型t（7；9）T細(xì)胞型4.慢

8、性淋巴細(xì)胞白血病2162的B-CLL有12三體異常，當(dāng)出現(xiàn)12三體以外的其他異?？寺。馕都膊∫堰M(jìn)入晚期。T-CLL常涉及14q11的易位。HCL病例可有del（6q），3及12號(hào)染色體三體，易位常涉及14q32。5.骨髓增生異常綜合征常見(jiàn)的異常克隆有5，7，85q及7因?yàn)橛歇?dú)特的臨床特征常稱(chēng)為“5q綜合征”和“7單體綜合征”，前者80發(fā)病年齡超過(guò)50歲，后者常見(jiàn)于兒童。許多資料表明有核型異常易演變成白血病。 第六節(jié) 血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)一、分子生物學(xué)技術(shù) 1.核酸分子雜交技術(shù)（1）Southern印跡雜交以放射性或非放射性標(biāo)記的DNA探針與固相支持體上的DNA雜交，對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行分析。（2）

9、Northen印跡雜交用DNA或RNA探針對(duì)待測(cè)RNA進(jìn)行分析。（3）核酸原位雜交標(biāo)記的DNA或RNA探針在組織、細(xì)胞及染色體上與其相關(guān)的核酸序列雜交，簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交（in situ hybridization）。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）：將標(biāo)記探針與中期或間期染色體雜交，間接免疫熒光與探針結(jié)合，染色體用碘化丙啶（PI）染色，熒光顯微鏡觀(guān)察，染色體呈紫紅色，染色體上的特異雜交帶呈另一顏色。 Southern Blot 操作步驟：DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)特定基因片斷擴(kuò)增PCRQ-PCR3.基因芯片又稱(chēng)DNA微陣列（DN

10、A microarray），固定大量以特定方式排列的基因探針或基因片段于硅片、玻片和塑料片上，待測(cè)DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，與微陣列雜交后再通過(guò)熒光掃描儀及計(jì)算機(jī)分析，可獲得關(guān)于待測(cè)樣品的大量基因序列及表達(dá)信息。二、惡性血液病融合基因 （1）慢性粒細(xì)胞白血病(CML)bcr-abl融合基因 （2）急性早幼粒細(xì)胞白血病(M3,APL)PML-RARa融合基因 （3）急性粒細(xì)胞白血病M2型的AML1-ETO融合基因（4）ALL免疫球蛋白重鏈（IgH）基因和T細(xì)胞受體（TCR）基因重排應(yīng)用：微量殘留?。ò籽〖?xì)胞）的檢測(cè)三、與遺傳有關(guān)血液病的診斷血紅蛋白病是常見(jiàn)的

11、遺傳性溶血性疾病血友病是常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病 第七節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)一、概念什么是 FCM ？流式細(xì)胞術(shù)：是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀(guān)，并且能夠同時(shí)檢測(cè)快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)細(xì)胞的多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選。 激光技術(shù)+流體力學(xué)+光電測(cè)量技術(shù)+計(jì)算機(jī)技術(shù)+細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)+單克隆抗體技術(shù)二、流式細(xì)胞儀（FCM，flow cytometer）1973年 推出世界第一臺(tái)流式細(xì)胞儀FACS I（Fluorescence Activated Cell Sorter）1980年中國(guó)的第一臺(tái)流式細(xì)胞儀FACS II生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、臨床

12、檢驗(yàn)等領(lǐng)域美國(guó)BD 公司成立于1897年，是世界上最大的醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療設(shè)備公司之一。業(yè)務(wù)分三大類(lèi)：BD醫(yī)療系統(tǒng)、BD生物科學(xué)系統(tǒng)、BD臨床實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)，經(jīng)營(yíng)的產(chǎn)品多達(dá)一萬(wàn)余種，足跡遍及世界，躋身財(cái)富五百?gòu)?qiáng)之列。BD FCM的特點(diǎn)測(cè)量速度快可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義高分辨率(CV（原幼粒、單細(xì)胞）單核細(xì)胞 成熟粒細(xì)胞非紅的原始/幼稚細(xì)胞,而幼紅細(xì)胞或漿細(xì)胞不表達(dá)。SSC（側(cè)向角光散射）其反映的是細(xì)胞的顆粒和核形復(fù)雜程度，SSC在成熟粒細(xì)胞最大單核細(xì)胞原/幼細(xì)胞與淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞。三、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用淋巴細(xì)胞免疫分型淋巴細(xì)胞亞群分析CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)HIV的診斷與研究淋巴細(xì)胞 CD4/CD8分析

13、CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)T細(xì)胞活化流式細(xì)胞儀的應(yīng)用免疫功能和免疫調(diào)控的研究淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化細(xì)胞因子的研究淋巴細(xì)胞的增殖樹(shù)突狀細(xì)胞的研究HLA-B27檢測(cè)流式細(xì)胞儀的應(yīng)用白血病和淋巴瘤免疫分型殘留白血病造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)PNH診斷網(wǎng)織紅細(xì)胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達(dá)血小板活化網(wǎng)織血小板分析流式細(xì)胞儀的應(yīng)用細(xì)胞周期分析腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究多藥耐藥基因的研究細(xì)胞凋亡的分析凋亡細(xì)胞的分析凋亡相關(guān)蛋白的分析四、細(xì)胞表型分析CD1982年國(guó)際人類(lèi)白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組（HLDA）設(shè)立，專(zhuān)門(mén)研究白細(xì)胞表面的分子，對(duì)有關(guān)細(xì)胞分化抗原的單克隆抗體進(jìn)行聯(lián)合鑒定和統(tǒng)一命名，使用分化群（Clusters of differentiation, CD）作為分化抗原的命名 。到2010西班牙Barcelona 舉行的第9屆HLDA國(guó)際會(huì)議已正式命名了363個(gè)CD 。CD抗體范圍已擴(kuò)大到各種血細(xì)胞，甚至之外的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，不再局限于白細(xì)胞，同時(shí)也由細(xì)胞表面擴(kuò)展到了細(xì)胞漿內(nèi)。HCDM (human cell differentiation molecules)白血病免疫分型常用的單抗主要特異性CDT細(xì)胞CD1,CD2,CD3,CD4,CD5,CD7,CD8B細(xì)胞CD10,CD19,CD20,CD21,C