色譜方法驗證審評指南

1、色譜方法通常用于原料、藥物、藥物制劑和生物體液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括 手性的或非手性的藥物、過程雜質(zhì)、殘留溶媒、附加劑如防腐劑、分解產(chǎn)物、從容器和密閉包 裝或制造過程中帶入的可提取和可過濾的雜質(zhì)、植物藥中的農(nóng)藥和代謝物等。試驗方法的目的是得到可信賴的和準確的數(shù)據(jù)，無論是用于驗收、出廠、穩(wěn)定性或藥物動力學 研究。得到的數(shù)據(jù)用于藥品開發(fā)或批準后的定性和定量，試驗包括原料的驗收、藥物和藥物制 劑的出廠、過程檢驗（In- process testing）的質(zhì)量保證和失效期的建立。方法的驗證是由藥品的開發(fā)者或使用者來檢驗其方法是否達到預期的可靠性、準確度和精密度 的過程。得到的數(shù)據(jù)成為方法

2、的驗證資料的一部分交給CDER.。方法的驗證對于完成機構(gòu)滿足檔案要求不是一次性的，開發(fā)者和使用者都應驗證其方法的耐用 度或耐久性（ruggedness or robustness.），其他的分析者、用其它相當?shù)膬x器，在其它的 日期或地點，在藥品生產(chǎn)期限（有效期）全過程，方法都應能夠重現(xiàn)。如果產(chǎn)生數(shù)據(jù)的方法是可 靠的，那么所得到的驗收、出廠、穩(wěn)定性或藥物動力學的數(shù)據(jù)就是可信賴的。驗證的過程和方 法的設計應在開發(fā)過程中重要的數(shù)據(jù)產(chǎn)生之前，如果方法改變了，還應該再驗證。色譜是一種技術，通過該技術，樣品中的組分載入液相或氣相中，通過在固定相上由吸附一解 吸附來完成。高效液相色譜（HPLC）HPLC分離

3、是基于在樣品在流動相液體和固定相之間的不同分配。一般地說HPLC大體分為以下 幾種（未考慮其重要性順序）手性液相色譜離子交換色譜離子對/親和色譜正相色譜反相色譜分子排阻色譜手性液相色譜分離光學異構(gòu)體可在手性固定相上，用衍生化試劑或在非手性固定相上用流動相添加劑形成非 對對映體來實現(xiàn)。用作雜質(zhì)試驗方法時，如果光學異構(gòu)體雜質(zhì)在光學異構(gòu)體藥物之前洗脫，要 增加靈敏度。離子交換色譜分離基于荷電功能團，樣品負離子（X -）為陰離子，樣品正離子（X + ）為陽離子，一般用pH 程序洗脫。離子對/親和色譜分離基于與目標樣品的專一的化學相互作用。更普遍的反相型用緩沖液和加入的對離子（與被 分離的樣品荷相反電荷

4、）分離。分離受pH、離子強度、溫度、濃度和共存的有機溶劑類型的影 響。親和色譜，一般用于大分子，使用配合體（共價結(jié)合在固體基質(zhì)上的生物活性分子），與 其同類的抗原（分析介質(zhì)）反應，生成可逆轉(zhuǎn)的復合物，通過改變緩沖條件洗脫。正相色譜正相色譜為用有機溶劑為流動相和極性的固定相。此時較小極性的組分比較大極性組分更快地 洗脫。反相色譜報給CDER的最通常的實驗方法是反相HPLC方法，最通常用紫外檢測器。反相色譜，一種鍵合相的色譜技術，用水作基本溶劑，選擇性也受溶劑強度、柱溫和pH的影 響，一般來說較大極性比較小極性組分洗脫更快。紫外檢測器可以用于所有色譜，這類檢測器要注意的是燈老化后的靈敏度降低，其靈

5、敏度因（儀器）的設計和/或者制造廠家的不同有小的變異。需要指出，用紫外檢檢測器和反相HPLC組 合得到的色譜圖不一定能真實的反映事實，原因是：極性比目標化合物大得多的化合物可能被掩蓋（在溶劑前沿或死體積時同時洗脫）。極性比目標化合物小得多的化合物洗脫出來晚，甚至保留在柱上。紫外吸收系數(shù)較低和最大吸收不同的化合物在檢測相對較低濃度的目標分析物時不能被檢 出，因為通常只有一個檢測波長。排阻色譜也叫凝膠滲漉（permeation）或濾過，分離基于化合物分子大小或水動力學（hydrodynamic）容 積。比多孔柱填料孔徑大得多的分子最先洗脫，小分子進入孔隙洗脫晚，其余的洗脫速率取決 于其分子的相對大

6、小。氣相色譜（GC）氣相色譜基于揮發(fā)性樣品由作為流動相的載氣運載，通過色譜柱內(nèi)的固定相時發(fā)生吸附和解吸 附過程進行分離。通常氣相色譜分析的樣品是低分子量化合物，這些化合物是易揮發(fā)的和高溫時穩(wěn)定的。在這一 方面，藥物和藥物制劑中的殘留溶劑適于氣相色譜分析。生成化學衍生物可達到易揮發(fā)和熱穩(wěn) 定的目的。常用的檢測器是用于含碳化合物的火焰離子化檢測器（FID），用于鹵代化合物的電子捕獲式 檢測器（ECD），用于含硫和含磷化合物的火焰光度檢測器（FPD），以及用于含氮或磷化合物 的氮磷檢測器（NPD）。氣相色譜也能實現(xiàn)手性分離。填充柱迅速被毛細管取代來改進分離度 和分析時間，在氣相色譜上分析物位置與HP

7、LC 一樣，用保留時間（Rt）表示。薄層色譜（TLC）薄層色譜是一種最簡便普通的色譜技術，分離基于在一端浸于溶劑混合物（流動相）中的薄層 板（固定相）上點的樣品移動進行分離，整個系統(tǒng)在密封的缸中進行。對于本身沒有顏色的化合物，檢出技術包括熒光、紫外和噴霧顯色劑（通用的和專一的）。分析物在薄層板上的位置用Rf值來表示，Rf值為化合物的移動距離與溶劑前沿的比值。三種方法，氣相、液相和薄層中，薄層色譜是最普通的試驗方法，因為薄層板上所有的組分都 可用適宜的檢測技術檢出。然而通常不如HPLC那么準確和靈敏。雖然選用適宜的檢測技術， TLC法能見到分析的“全圖”（whole picture），但比HPL

8、C分析變異較大。.參考標準品（對照品）參考標準品為經(jīng)充分鑒定的高純度化合物，色譜方法更大程度上依賴參考標準品來提供準確的 數(shù)據(jù)。因而參考標準品的質(zhì)量和純度是很重要的，有二類參考標準品，化學的和放射性的。后 者應考慮放射標記純度和化學純度。按照提交方法驗證的樣品和分析數(shù)據(jù)，指南中的二類化學參考標準品如下：-USP / NF參考標準品，不需要鑒定。-非總目錄標準品，應用合理方法制備，并經(jīng)充分鑒定，以保證其鑒別、含量、質(zhì)量和純度 達到最高。應該指出-大多數(shù)USP / NF參考標準品未標示化合物純度。-對非USP參考標準品，提出純度的校正數(shù)應包括在試驗方法的計算中。-提供的參考標準品中沒有以下雜質(zhì)，諸

9、如合成過程的結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)和其它的過程雜質(zhì)， 如重金屬、殘留溶劑、水分（結(jié)合的和非結(jié)合的）、植物來源制劑中的農(nóng)藥和分解產(chǎn)物等。-如果在方法中規(guī)定，用前參考標準品要干燥除去殘留溶劑、非結(jié)合水分和有時是結(jié)合水（取決于干燥條件），對易潮解的化合物總是包括干燥步驟的。但另一方面干燥可能導致結(jié)晶 水的損失或引起熱敏感化合物的降解。色譜方法用外標法和內(nèi)標法進行定量。外標法當參考標準品與樣品在不同的色譜圖上進行分析時，用外標法。定量基于樣品的峰面積/高 （HPLC或GC）或強度（TLC）與分析對象、參考標準品的比值。更適合用外標法的樣品如下：樣品具有單一的目標濃度和狹窄的濃度范圍，例如驗收和出廠檢驗。簡便的

10、樣品制備操作。增加走基線的時間，為檢測可能的額外峰，如雜質(zhì)試驗。內(nèi)標法加入一種已知純度并且在分析中不產(chǎn)生干擾的化合物至樣品混合液中，定量基于被分析的化合 物與內(nèi)標的響應比值與參考標準品得到的比值進行比較。這一方法很少用于TLC。更適合用內(nèi)標法的樣品如下：復雜的樣品制備過程，如多次提取。低濃度的樣品（靈敏度是確定的），如藥代動力學的研究。在樣品分析中預計是很寬的濃度范圍，如藥物動力學研究。雖然CDER不規(guī)定方法應該用內(nèi)標或外標法用于定量，但一般的看法是用于驗收、穩(wěn)定性和TLC用外標法，對生物體液和GC用內(nèi)標法。工作濃度為方法中規(guī)定的被分析對象的目標濃度。保持樣品濃度與標準的濃度相近可以改善方 法

11、的準確性。建議如果參考標準品的純度校正因子已知，那么在計算中應該包括。在方法中要規(guī)定標準品和樣品的工作濃度。2005-2-13 8:24:00 IP:60.55.40.250主題：RE:分享色譜方法驗證審評指南（轉(zhuǎn)貼）查看該用戶在資料中心上傳的資料個人資料給他留言帖子合集回復引用維護.藥物和藥物制劑HPLC驗證的參數(shù)雖然許多種HPLC都可采用，但最普遍上報的方法都是用紫外檢測器的反相HPLC法，以此作為 驗證參數(shù)的例子。這一方法驗證的規(guī)定可以擴展到其它檢測器和其它色譜。對于驗收、出廠或 穩(wěn)定性試驗，準確性應最佳化，因為要表明實測值和真值的差異是最為關注的。準確性準確性是衡量測量實驗值和真值的接

12、近程度。推薦藥物和藥物制劑的準確性研究在標示量的 80%、100% 和 120% 的水平上來進行的，這與 “The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation ”的規(guī)定是一致的。對于藥物制劑，準確性試驗通常是將已知量的藥物按重量或體積（溶于稀釋劑）以分析對 象檢測濃度的線性范圍量加到空白處方內(nèi)來完成的。對于液體制劑，這是真實的回收率；而對 于諸如片劑、栓劑、透皮吸收制劑等，這不能檢測稀釋劑中的賦形劑與活性成分間可能產(chǎn)生的 作用。實際上要做一個已知活性藥物量的單個劑量單位（single un

13、it）來進行回收試驗是困 難的。準確性試驗評價在賦形劑存在時，在分析藥物制劑的色譜條件下，試驗方法的專屬性。 但這只是樣品制備過程和色譜過程中的回收率，而不是制造過程的影響。在每個推薦檢測濃度重復進樣，其重復進樣的RSD提供了分析方法的變動性，或是試驗方法的 精密程度。重復性的均值以標示量的來表示，這表明試驗方法的準確程度。建議回收試驗在每個水平上（標示量的80%、100%和120%）至少做3份，均數(shù)用來估計準確性的， RSD是估計樣品分析精密度的。檢出限和定量限這些限度通常用于藥物和藥物制劑中有關物質(zhì)的測定。限度的規(guī)定連同藥物和藥物制劑出廠和 穩(wěn)定性有關的調(diào)整雜質(zhì)量的方法一起要上報。檢出限度

14、是樣品中分析對象在實驗條件下可被檢出的最低限度，但不要求定量。定量限度是樣 品中分析對象在實驗條件下，以可接受的精密度和準確性定量測定的最低濃度。使用UV檢測器時，保證低濃度化合物的檢測精密度是困難的，這是由于檢測器的燈隨著壽命 的延長可能逐漸減小其靈敏度，不同檢測器制造廠家的躁聲水平也不同。在低濃度時，保證每 次試驗方法能達到檢出限度和定量限度是必要的。指定的雜質(zhì)無對照品，但是又要保證檢出 限，額外峰可能不出現(xiàn)或出現(xiàn)。對評價額外峰檢出的可行的粗糙方法是用以分析對象峰面積的 百分比的要求作為檢出限。例如檢出限要求分析對象峰面積50000的0.01%，那么給出面積 計數(shù)為5,則不能檢出。雖然US

15、P表示檢出限和定量限分別用躁聲水平的2或3和10倍表示，但這一概念不是很實際 的。在方法研究階段，用不同的檢測器分析樣品時，檢測器的躁聲水平是不同的。在定量限水 平的試驗方法中使用對照品（由申報者提供）能保證雜質(zhì)可被檢出和被定量。檢測器靈敏度因型號和制造廠家的不同而異，見表1。用二種商用檢測器分析一種化合物，這 些數(shù)據(jù)不應作為二種檢測器靈敏度預期的比例。在設定這些限度時，因為還有起部分作用的其 它參數(shù)，如燈和柱的壽命，但它們是不知道的。表1二種商用檢測器的檢出靈敏度限度比較檢測器1檢測器2定量限度0.21% 0.07%檢出限度0.16% 0.05%人們應該注意，基線躁聲不應解釋為額外峰。如果樣

16、品的稀釋劑與流動相所用的溶劑不同（比 例或類型），亦可能在死體積處見到波動。如果有目標化合物的參考標準品，那么要使用接近定量限的或按規(guī)定配制的標準溶液。記錄沒 有參考標準品的雜質(zhì)峰時，推薦使用藥物的稀釋液作為參考標準溶液。然后對方法要進行校 正，測定的高低濃度都要在藥物檢出線性范圍內(nèi)，否則用相同色譜圖下面積或峰高的表示是 有偏差的。應該注意得到的用面積計數(shù)的額外峰不能被認為是取決于該化合物UV吸收系數(shù)或 吸收度的檢出響應。建議分析重現(xiàn)性和進樣重現(xiàn)性數(shù)據(jù)應在定量限度范圍內(nèi)。在試驗方法的定量限的濃度處，用一外加的參考標準溶液。線性符合比耳定律的可檢出的線性范圍取決于被分析化合物和所用的檢測器。工作

17、樣品的濃度和準 確性試驗樣品的濃度應在線性范圍內(nèi)。圖1和2表明UV響應和濃度的（a）線性和非線性關系。有一點應該注意，當記錄雜質(zhì)峰時 （用母體藥物的面積表示），如果使用非線性的濃度曲線部分，觀察到的雜質(zhì)可能不是理論 計數(shù)的真實反映。另外，僅當雜質(zhì)和母體化合物的吸收系數(shù)或吸收度值相同時才能得到真實的 量。雜質(zhì)參考標準品通常是必需的。建議檢測的線性范圍取決于試驗方法的目的，用于含量測定方法的推薦范圍為不得過土 20%，以峰 面積%計的測定雜質(zhì)的范圍是目標濃度的+20%，低至藥物或雜質(zhì)的定量限。在大多數(shù)情況下， 回歸系數(shù)要0.999,截距和斜率應標明。精密度精密度為在相同分析條件下的一組測量值相互接

18、近的程度。ICH定義精密度含有3個部分，即 重復性（repeatability ）組間精密度（intermediate precision ）和重現(xiàn)性（reproducibility ）。在 USP 1990，1225 頁中的耐用度（ruggedness ）具體體現(xiàn)在這一指 南的組間精密度，重現(xiàn)性和耐久性（robustness ）概念中。重復性a. 進樣重復性靈敏度是檢出樣品中分析對象濃度小量的變化的能力。靈敏度可以通過系統(tǒng)適用性試驗中的進 樣重現(xiàn)性的規(guī)定來部分的控制。多次注射均一樣品（制備的溶液）測量的靈敏度和精密度，表明在色譜條件下測定當天HPLC 儀器的性能。這一信息作為驗證數(shù)據(jù)和系統(tǒng)適

19、用性試驗的一部分。以百分變異系數(shù)（CV%）或 相對標準偏差（RSD）的規(guī)定來測定其分析的變異限度。值越接近人們可以期待結(jié)果更精密或 對結(jié)果的變化更靈敏。這是假設在系統(tǒng)適用性試驗后色譜儀功能未失常的情況下的。然而要注 意這不是考慮由藥品制造和實驗室樣品制備引起的變異。作為進樣和R t的變異的例子，表2 提供了在進樣過程中色譜系統(tǒng)漏液時收集的數(shù)據(jù)。四個重復的樣品分別進樣，注意其峰面積的 變異和保留時間的漂移。從性能良好的系統(tǒng)得到的一組典型數(shù)據(jù)見表3。表2進樣中色譜系統(tǒng)系統(tǒng)漏液時的重復性數(shù)據(jù)樣品R t峰面積AR t峰面積A1A2 5.625.66 21556992120466 0.04 35233B

20、1B2 5.876.13 22056592288355 0.26 82696C1 C2 6.216.48 22270662265279 0.27 38213D1 D2 6.736.99 25818882602016 0.26 20128表3色譜系統(tǒng)功能正常時的進樣重復性數(shù)據(jù)劑型N均數(shù)土 SD RSD吸入溶液 10 1993162 5029 0.25%吸入用溶液 10 1722253 6288 0.37%膠囊 10 1744320 3133 0.18%建議作為方法驗證的一部分，建議最少10次進樣，RSDW1%。對于藥物或藥物制劑中的活性成分出 廠和穩(wěn)定性研究，其RSDW1%。系統(tǒng)適用性試驗的精密度RSD至少5次進樣。對低濃度雜質(zhì)， 較高的變異系數(shù)可以接受。b.分析重復性分析重復性由同一分析者在相同的實驗條件下進行的多次測量，用RSD表示。實際上，它常常 與準確性一起進行研究，見.A部分準確性項下。組間精密度組間精密度以前作為持久穩(wěn)定性的一部分。該數(shù)據(jù)用來評價在與方法研究過程不同的條件下的 方法可靠性。目的是保證同樣的樣品在方法研究期后進行分析能得到相同的結(jié)果。取根據(jù)時間和條件，方法可以在多天、多個分析工作者和多臺儀器上試驗。良好的系統(tǒng)適用性試驗規(guī)定可以部分地保證試驗方法的組間精密度。因此設定嚴格的但實際的 系