微生物限度檢查方法學驗證方案

1、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺微生物限度檢查方法驗證方案報告編號：SVL-VP020-11密級：保密文件 主責部門：質量控制部執(zhí)行日期：二 0 年七 月 二十一 日文 件 目 錄序 號內(nèi) 容頁 碼1驗證審批第3頁2驗證小組成員、職責第3頁3驗證支持文件第4頁4儀器校驗第5頁5驗證具體內(nèi)容第5頁概述第5頁驗證目的第5頁驗證時間第5頁驗證內(nèi)容第6頁6驗證結果第13頁7偏差處理情況第13頁8驗證評價第14頁9驗證報告審批第14頁10數(shù)據(jù)附件（原始數(shù)據(jù)）第14頁1. 驗證審批：部 門姓 名主責部門起草人張金花質量部QC主管審核顧黎娟驗證領導小組副組長張廣永驗證領導小組組長張新榮2驗證小組成員、職責：姓 名部

2、門 / 職務驗 證 分 工驗證小組組長，負責驗證方案編制并組織實施批準后的方案及驗證資源的協(xié)調，匯總并形成驗證報告。 負責驗證工作中的協(xié)調工作，以保證本驗證方案規(guī)定項目的順利實施；負責對相關文件和資料進行檢查。偏差情況的調查、分析、處理和匯總。負責設備操作，并對操作參數(shù)進行記錄。負責審核驗證方案和報告，對檢驗結果作出評價和建議。負責對相關文件和資料進行檢查復核；負責取樣和檢驗結果匯總負責檢驗結果復核, 檢驗記錄審核。負責樣品檢驗。負責樣品檢驗。配合驗證實施，保證驗證設備運轉正常。3. 驗證支持文件序 號文 件 名 稱文 件 編 號1驗證管理規(guī)程2驗證文件管理規(guī)程3清潔驗證管理規(guī)程4工作服管理規(guī)

3、程5潔凈區(qū)衛(wèi)生管理規(guī)程6-型洗衣機操作程序7-型干衣機操作程序8清潔劑和消毒劑配制使用操作程序9清潔工具清潔與消毒操作程序10潔凈區(qū)容器具清潔操作程序11-型洗衣機清潔操作程序12-型干衣機清潔操作程序13洗衣工序清場14微生物限度檢查法操作程序檢查人： 日 期：復核人： 日 期：4. 儀器校驗：序號儀器名稱及型號器具編號有效期至檢定單位檢定證書編號1培養(yǎng)箱2培養(yǎng)箱3 立式壓力滅菌鍋（壓力表）鼓風干燥箱架托天平檢查人： 日 期： 復核人： 日 期：5驗證具體內(nèi)容：5.1 概述：根據(jù)中華人民共和國藥典2010年版二部附錄C微生物限度檢查法的要求，為保證驗證檢驗質量，確保檢驗結果的準確性和可靠性，

4、對微生物限度方法學驗證工作進行了考察，現(xiàn)將測定結果報告如下： 驗證目的：為確保所采用的方法適合于該藥品微生物限度檢查，特進行方法學驗證試驗。判斷標準：試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)、限制菌數(shù)。試驗內(nèi)容.1供試品：L-丙氨酰-L-谷氨酰 批號 、 、 .2培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（ ）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（ ）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（ ）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（ ）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（ ）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（ ）、改良馬丁培養(yǎng)基（ ）以上培養(yǎng)基均由中國藥品生物制品檢定所提供。.3試驗菌種 大腸埃希菌 、金黃色葡萄球菌 、枯草芽孢桿菌 、白色

5、念珠菌 、黑曲霉 .以上菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供。6、菌液的制備6.1 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10ml中，30356.2 取經(jīng)3035培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基各1ml加到9ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-76.3 接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23286.4 取經(jīng)2328培養(yǎng)4872小時培養(yǎng)的白色念珠菌1ml含加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-66.5接種黑曲霉新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培

6、養(yǎng)基中，23286.6取經(jīng)2328培養(yǎng)57天的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，加入35ml 含0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，按10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-76.7菌數(shù)計數(shù)：6分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3種菌液（100cfu/ml）1ml注入無菌培養(yǎng)基中，每種菌液平行2個平皿，注入456分別取白色念珠菌,黑曲霉2種菌液(100cfu/ml)1ml注入無菌培養(yǎng)皿中,每種菌液平行2個平皿,注入45左右的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基約1520ml,2328表1L-丙氨酰-L-谷氨酰菌名金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉稀釋級10-61ml10

7、-61ml10-61ml10-51ml10-51ml1 2 平均數(shù) 注：金黃色葡萄球菌（第 代）、大腸埃希菌（第 代）、枯草芽孢桿菌（第 代）、白色念珠菌（第 代）、黑曲霉（第 代）。7、方法驗證：7.1 方法：采用平皿計數(shù)法7.2 稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（PH=7）0.9%無菌氯化鈉溶液7.3 取樣量：按中國藥典2005年版規(guī)定的取樣方法，供試品的檢驗量為10g。7.4 供試品：取供試品10g蛋白胨緩沖溶液100 ml中，振搖，使成1：10的的供試液。7.5 試驗方法7試驗組：取供試液1ml（1：10）注入無菌平皿中，分別注入5種（50-100cfu/ml）的試驗菌，并立即傾

8、注45左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基約1520ml，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在3035培養(yǎng)48小時；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基在237菌液組：取各菌種液1ml（50-100cfu/ml，同6.5.1操作，按平皿法計數(shù)菌數(shù)）。7供試品對照組：依照微生物限度檢查操作規(guī)程，取供試品10g，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振蕩，溶解混勻，分別制備1：102及1：103的供試液，取供試液1ml（1：10），同6.5.1操作，按平皿法測定供試品本底菌數(shù)。7稀釋劑對照組：稀釋劑為0.9%無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（PH=7），無抑菌作用，不作考察。8、實驗結果記第一次：表1 大腸埃希菌的回收率：試驗

9、組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表2 金黃色葡萄球菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表3 枯草芽孢桿菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表4 白色念珠菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表5 黑曲霉的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 第二次：表1 大腸埃希菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表2 金黃色葡萄球菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表3 枯草芽孢

10、桿菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表4 白色念珠菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表5 黑曲霉的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 第三次：表1 大腸埃希菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表2 金黃色葡萄球菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表3 枯草芽孢桿菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表4 白色念珠菌的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2

11、表5 黑曲霉的回收率：試驗組菌液組供試品對照組回收率菌數(shù)皿1皿2皿1皿2皿1皿2 9.測定結果：按照中國藥典2010年版微生物限度檢查法中常規(guī)法檢查，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，無抑菌作用，可照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌和霉菌及酵母菌。10控制菌檢查：按照中國藥典2010年版微生物限度檢查法進行控制菌的方法學驗證試驗及檢查。10.1大腸埃希菌10菌液制備：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌同6.1、6.2項下供試液的制備。10供試液的制備：同7.4項下供試液的制備。10驗證方法10.1試驗組大腸埃希菌 取供試液（1：10）10ml，加

12、入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，重復兩份，其中1份為供試品組，另一份加入大腸埃希菌10100cfu/ml作為試驗組，另取大腸埃希菌10100cfu/ml加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中作陽性對照，3035培養(yǎng)1824小時，取上述增菌液0.2ml，加入5mlMUG試管中，置303510.2陰性對照組 取供試液（1：10）10ml，加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，加入金黃色葡萄球菌10100cfu/ml作為陰性對照，3035培養(yǎng)1824小時，取上述增菌液0.2ml，加入5mlMUG試管中，置3035表3 L-丙氨酰-L-谷氨酰陽性組供試品組試驗組大腸埃希菌MUG顛基質MUG顛基質MUG顛基質陰性菌-金

13、黃色葡萄球菌（23cfu/ml）注：金黃色葡萄球菌的稀釋級為10-710.2大腸菌群 按照中國藥典2010年版微生物限度檢查法進行大腸菌群的方法學驗證試驗及檢查。10菌液制備：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌同6.1、6.2項下供試液的制備。10供試液的制備：取7蛋白胨緩沖溶液9 ml，即為1：1000的供試液.10驗證方法.1試驗組 取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml、1：100的供試液1ml、1：1000的供試液1ml，重復2份，其中1份為供試品組，另一份加入大腸埃希菌10100cfu/ml作為試驗組，另取大腸埃希菌10100cfu/ml加入膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基

14、管中作陽性對照，303510.2陰性對照組 取含10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10；1：100；1：1000的供試液1ml，再分別加入金黃色葡萄球菌10100cfu/ml作陰性對照，3035表4 L-丙氨酰-L-谷氨酰實驗組菌數(shù)（個/ml）1：101：1001：1000檢出結果（個/g）供試品組陽性對照組（大腸埃希菌）試驗組陰性對照組（金黃色葡萄球菌）11結論根據(jù)上述驗證試驗結果，確定本品微生物限度檢查方法測定即可。樣品測定11.1細菌、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定樣品測定結果見表6表6 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺批號項目細菌總數(shù)測定霉菌和酵母菌總數(shù)測定稀釋倍數(shù)1：1011：1021

15、：103陰性對照1：1011：1021：103陰性對照12均值結論稀釋倍數(shù)1：1011：1021：103陰性對照1：1011：1021：103陰性對照12均值結論稀釋倍數(shù)1：1011：1021：103陰性對照1：1011：1021：103陰性對照12均值結論11.2大腸埃希菌測定 測定結果見表7.表7 L-丙氨酰-L-谷氨酰批號MUG-1結果5小時24小時陰性對照陽性對照11.3大腸菌群測定 測定結果見表8.表8 L-丙氨酰-L-谷氨酰批號可能的大腸菌群數(shù)N(個/g)陰性對照陽性對照由上述檢測結果可知，樣品符合規(guī)定12. 驗證結果：撰寫人： 日期：復核人： 日期：13偏差處理情況：13.1. 驗證過程中，若出現(xiàn)不需改變本驗證方案的偏差，則進行偏差處理后繼續(xù)實施驗證，同時將糾偏措施和糾偏結果記錄在驗證報告之中；13.2. 驗證