蛋白質(zhì)化學(xué)修飾

1、關(guān)于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾第一張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月主 要 內(nèi) 容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第二張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、化學(xué)修飾的原理概念：從廣義上說，凡是通過化學(xué)基團的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，都可稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。有的情況下化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(稱非必需部分的修飾); 但大多情況下將導(dǎo)致生物活性的改變(如下降以至完全喪失)。影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進程的因素： 1.蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性；2.修飾劑的反應(yīng)性。第三張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月主 要

2、 內(nèi) 容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第四張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾主要是通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實現(xiàn)的。其重要作用是用于探測活性部位的結(jié)構(gòu)。理想情況下, 修飾試劑只是選擇性地與某一特定的殘基反應(yīng), 很少或幾乎不引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。在20種常見AA殘基中，僅具極性的側(cè)鏈基團才能夠進行化學(xué)修飾，這些基團的反應(yīng)性取決于其親核性。第五張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種方法

3、） 2.2 巰基的化學(xué)修飾2.3 氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4 羧基的化學(xué)修飾2.5 咪唑基的化學(xué)修飾2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾第六張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種） 2.1.1 ?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng) 這類化學(xué)修飾試劑如乙酰咪唑、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基異脲等，在室溫(20C25C)，pH 4.5 9.0的條件下可與蛋白質(zhì)某些側(cè)鏈基團如 -NH2、-OH、-SH及酚基等發(fā)生?；磻?yīng)。第七張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1.2 烷基化反應(yīng) 此類試劑 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰鹵代物、碘甲烷等 )

4、 常帶有活潑的鹵素原子，因其電負性而使烷基帶部分正電荷，易于導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的親核基團 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 發(fā)生烷基化。第八張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1.3 氧化和還原反應(yīng)H2O2、N-溴代琥珀酰亞胺等具有很強氧化性，能將側(cè)鏈基團( -SH-SCH3吲哚基咪唑基和酚基)氧化, 往往易使肽鏈斷裂(故要控制好氧化條件); 光敏劑存在下的光氧化是比較溫和的氧化作用。2-巰基乙醇、巰基乙酸和二硫蘇糖醇(DTT)等主要用于-S-S-的還原劑。連四硫酸鈉或鉀是一溫和的氧化劑，常用于-SH的可逆保護劑。第九張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6

5、月2.1.4 芳香環(huán)取代反應(yīng)蛋白質(zhì)AA殘基的酚羥基在3和5位上易于發(fā)生親電取代的碘化和硝化反應(yīng)。這類修飾反應(yīng)的典型例子為四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的酚羥基, 形成3-硝基Tyr衍生物。這種產(chǎn)物有特殊光譜，可用于直接的定量測定。第十張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種方法） 2.2 巰基的化學(xué)修飾2.3 氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4 羧基的化學(xué)修飾2.5 咪唑基的化學(xué)修飾2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾第十一張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.2 巰基的化學(xué)修飾巰基具有很強的親核性，是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的

6、側(cè)鏈基團。常用的修飾劑有3種：1.烷基化試劑特別是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH修飾劑。修飾產(chǎn)物相當(dāng)穩(wěn)定，易于分析。此類試劑還能與MetLysHis反應(yīng)。第十二張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.有機汞試劑是最早使用的-SH修飾劑之一，其中最常用的是對氯汞苯甲酸，它與-SH形成的衍生物在250nm處有最大吸收，可容許低濃度蛋白質(zhì)的光譜定量分析。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)與蛋白質(zhì)分子中側(cè)鏈-SH反應(yīng)很快,并在395nm處產(chǎn)生1個負差吸收峰.3.-SH的氧化也是一種專一性很高的化學(xué)修飾手段. H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在較大量時形成磺酸，也可以生成次磺酸。第十

7、三張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種方法） 2.2 巰基的化學(xué)修飾2.3 氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4 羧基的化學(xué)修飾2.5 咪唑基的化學(xué)修飾2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾第十四張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.3 氨基的化學(xué)修飾氨基的修飾可分為三類：引入正電荷的修飾；電荷消失的修飾；引入負電荷的修飾。第十五張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.3.1 引入正電荷的修飾Lys-NH2以非質(zhì)子化形式存在時很活潑, 是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng)活性很高的基團，可被選擇性修飾。Lys修飾后側(cè)鏈留下可電離的帶正電的基團。

8、還原烷基化：醛與Lys側(cè)鏈反應(yīng)形成希夫堿，再用硼氫化鈉（NaBH4）還原希夫堿，得到穩(wěn)定衍生物。 P-NH2 + RCHO P-N=CHR P-NH-CH2R -H2O+H2OH第十六張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.3.2 電荷消失的修飾這類試劑可抑制Lys-NH2的質(zhì)子化, 使形成的衍生物不帶電。1. 乙?；涸谖A性pH下，氨基與乙酸酐反應(yīng)生成乙?；苌铩?. 芳香化：三硝基苯磺酸與氨基作用, 生成的衍生物為黃色，可定量測定-NH2。 (其它:DNFBDNS)三硝基苯磺酸 (TNBS)第十七張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.3.3 引入負電荷的修飾1. 乙?；?

9、 此反應(yīng)類似于乙酸酐與氨基反應(yīng), 但酸酐(如琥珀酸酐)所帶負電荷全部引入到側(cè)鏈上。2. 烷基化：第十八張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種方法） 2.2 巰基的化學(xué)修飾2.3 氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4 羧基的化學(xué)修飾2.5 咪唑基的化學(xué)修飾2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾第十九張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.4 羧基的化學(xué)修飾由于羧基在水溶液中的化學(xué)性質(zhì), 使得蛋白質(zhì)分子中Glu和Asp的修飾很有限, 產(chǎn)物一般是酯類或酰胺類.目前最常用的標(biāo)準(zhǔn)方法, 在比較溫和的條件下就可進行胃蛋白酶與14C硼氟化三甲洋鹽在pH

10、5時酶完全失活,研究表明兩-COOH為該酶必需基團第二十張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種方法） 2.2 巰基的化學(xué)修飾2.3 氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4 羧基的化學(xué)修飾2.5 咪唑基的化學(xué)修飾2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾第二十一張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.5 咪唑基的化學(xué)修飾His殘基的咪唑基可通過N原子的烷基化或C原子的親核取代來進行修飾。 焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的His殘基的修飾試劑,在近中性時專一性較好, 使His殘基的咪唑基上1個N羧乙基化, 并使得在240nm處的光吸收增加。在堿性條件

11、下該取代反應(yīng)是可逆的。第二十二張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾2.1 特定的AA殘基側(cè)鏈基團的反應(yīng)試劑（4種方法） 2.2 巰基的化學(xué)修飾2.3 氨基的化學(xué)修飾（3種方法）2.4 羧基的化學(xué)修飾2.5 咪唑基的化學(xué)修飾2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾第二十三張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2.6 二硫鍵的化學(xué)修飾同-SH類似, -S-S-具有其特有的特性, 可用來進行特異的修飾, 通常是通過還原的方法. 這些方法通常與某些-SH修飾方法結(jié)合,以阻止再氧化成-S-S-或計算斷裂開的-S-S-數(shù)目。常用的有: 巰基乙醇(具高度選擇性和長的半衰期. 但要有變性劑, 且使用

12、大大過量的巰基乙醇)、 Cleland 試劑包括二硫蘇糖醇(DTT)及其差向異構(gòu)體二硫赤蘚糖醇(DTE) (勿需過量還原劑)。-S-S-經(jīng)還原成為-SH，一般情況下很容易自動氧化，故需經(jīng)過羧甲基處理防止重新氧化。第二十四張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月主 要 內(nèi) 容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第二十五張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)雙功能試劑：指具有兩個反應(yīng)活性部位，可在相隔較近的兩個氨基酸殘基間搭橋、形成多肽鏈內(nèi)、鏈間或蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，而不引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變的試劑。雙功能試劑還可將一

13、蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)到一個化學(xué)惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白質(zhì)。表征交聯(lián)在一起的氨基酸殘基或蛋白質(zhì), 可提供許多關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)間相互作用的信息。第二十六張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月交聯(lián)劑的應(yīng)用研究蛋白質(zhì)的折疊: 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度很大時, 交聯(lián)劑也能形成分子間的交聯(lián)鍵, 使蛋白質(zhì)對變性趨于穩(wěn)定。 如Rajput等用戊二醛將胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交聯(lián)在一起。這種固定化的雜化酶的優(yōu)點是，顯著地降低了雜化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同時也使反應(yīng)器的體積大大縮小。 酶分子內(nèi)的交聯(lián)?？商岣呙阜肿訕?gòu)象的穩(wěn)定性，防止酶失活。因此，設(shè)法增加酶分子表面交聯(lián)鍵的數(shù)目是酶固定化的方法之一。第二十七

14、張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3 交聯(lián)劑的應(yīng)用測定蛋白質(zhì)亞基的量: 如用辛二亞氨酸二甲酯作用于齊聚體蛋白質(zhì), 使在同一亞基內(nèi)和多亞基間的Lys殘基之間形成交聯(lián), 再進行SDS, 則可測定其分子量和亞基的數(shù)目, 以闡明亞基的組合情況(如單體、二聚體還是三聚體等）。 用交聯(lián)劑還能測定蛋白質(zhì)上殘基間的距離。如用跨度為0.371.45nm的一系列亞氨酯交聯(lián)糖原磷酸化酶b, 再結(jié)合SDS系統(tǒng)測定出, 在有效交聯(lián)形成的四聚體上的兩Lys殘基間距離約為0.8nm。第二十八張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月主 要 內(nèi) 容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用

15、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性第二十九張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用5.1 用于測定蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸的數(shù)量研究蛋白質(zhì)性質(zhì)時，常需測定其中含有某種AA的數(shù)量。當(dāng)然用AA分析法可得到此數(shù)據(jù)。但當(dāng)只需知道某一AA的數(shù)量, 不需知道其它AA數(shù)量時, 則應(yīng)建立僅對某一氨基酸的快速靈敏的分析方法, 實際上是用于蛋白質(zhì)定量化學(xué)修飾。常用且靈敏度高的方法是對氯汞苯甲酸與-SH作用; 三硝基苯磺酸與-NH2作用。用熒光法可測定微量蛋白質(zhì), 靈敏度高，常用熒光胺。第三十張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5.2 在蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用用于測定蛋白質(zhì)及多肽化學(xué)結(jié)構(gòu)的許多方法

16、都是以蛋白質(zhì)化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的。A. 控制酶解程度: 如常用胰蛋白酶專一水解堿性氨基酸(Arg和Lys)的-COOH所形成的肽鍵。若要使胰蛋白酶只水解Arg所形成的肽鍵, 可用三氟乙?；▽ys-NH2保護起來, 使它轉(zhuǎn)變?yōu)槊覆荒芩獾漠a(chǎn)物。B. 化學(xué)裂解: 最理想且普遍采用的是CNBr專一性裂解Met的-COOH所形成的肽鍵。第三十一張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5.3 確定蛋白質(zhì)殘基的功能化學(xué)修飾結(jié)合保護實驗可研究底物或其它配位體對修飾速度和程度影響。如用磷酸吡哆醛修飾Fru-6-P激酶時, 發(fā)現(xiàn)有兩個Lys被修飾, 酶活力喪失; 而在Fru-2,6-PP存在時, 則可減弱修飾

17、作用, 保護激酶活力。若修飾的可逆性與生物功能的改變有對應(yīng)關(guān)系,也可為確定某一殘基的可能功能提供有利證據(jù);用于蛋白質(zhì)變構(gòu)部位上必需AA殘基的分析, 以及協(xié)同作用所必需殘基的表征。第三十二張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5.4 蛋白質(zhì)化學(xué)修飾在生物工程中的應(yīng)用提高酶的穩(wěn)定性：酶的固定化技術(shù)改變酶的專一性：黃素的溴酰衍生物可與木瓜蛋白酶的-Cys共價結(jié)合，結(jié)果將有水解活性的木瓜蛋白酶轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂醒趸€原活性的黃素木瓜蛋白酶。創(chuàng)造新的酶活性：許多重要的生物活性肽含D-AA，因肽酶只對L-AA有專一性，因此不可能在肽酶催化下合成含有D-AA的肽。生產(chǎn)實踐上的應(yīng)用：醫(yī)藥(甲醛使細菌毒素和病毒改性)、毛紡(羊毛染色)、食品(去除雜味怪味)等。第三十三張，PPT共三十六頁，創(chuàng)作于2022年6月主 要 內(nèi) 容化學(xué)修飾的原理蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋