DNA重組技術(shù)基本工具課件

1、專題1 基因工程1-1 DNA重組技術(shù)的基本工具第1頁(yè)，共33頁(yè)。基因工程的概念基因工程：指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。第2頁(yè)，共33頁(yè)?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程原理目的基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定向改造生物的遺傳性狀剪切 拼接 導(dǎo)入 表達(dá)基因重組基因工程的概念理解第3頁(yè)，共33頁(yè)。問(wèn)題探討： 蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋

2、白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。想一想：需要做哪些關(guān)鍵工作？普通棉花抗蟲(chóng)棉第4頁(yè)，共33頁(yè)?；蚬こ膛嘤瓜x(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)與運(yùn)載體DNA拼接，導(dǎo)入棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)表達(dá)第5頁(yè)，共33頁(yè)?；蚬こ膛嘤瓜x(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞第6頁(yè)，共33頁(yè)。解決培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針” DNA連接酶“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體第7頁(yè)，共

3、33頁(yè)。1-1 DNA重組技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀” 限制酶 “分子縫合針” DNA連接酶 “分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 第8頁(yè)，共33頁(yè)。識(shí)別雙鏈DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。主要從原核生物分離純化出來(lái)4000種。 1、來(lái)源： 2、種類：3、作用：5、結(jié)果：形成兩種末端一、“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶黏性末端平末端4、切割方式：錯(cuò)位切和平切第9頁(yè)，共33頁(yè)。ATGCATGC限制酶切割磷酸二酯鍵第10頁(yè)，共33頁(yè)。限制性內(nèi)切酶作用過(guò)程點(diǎn)擊播放第11頁(yè)，共33頁(yè)。 1、大腸桿菌的一種限制酶（EcoR)能識(shí)別GAATT

4、C序列，并在G和A之間切開(kāi)形成黏性末端。 2、Sma能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端 。常見(jiàn)的兩種限制酶第12頁(yè)，共33頁(yè)。Sma平末端平末端第13頁(yè)，共33頁(yè)。EcoR黏性末端黏性末端第14頁(yè)，共33頁(yè)。什么叫黏性末端？ 當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開(kāi)時(shí)，被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。第15頁(yè)，共33頁(yè)。什么叫平末端？ 當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。第16頁(yè)，共33頁(yè)。尋根問(wèn)底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？ 原核

5、生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。第17頁(yè)，共33頁(yè)。為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？ 通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

6、 尋根問(wèn)底第18頁(yè)，共33頁(yè)。1、要想獲得某個(gè)目的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？一個(gè)目的基因有幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端，兩個(gè)。2、如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？ 會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端。3、是不是把兩者的黏性末端黏合起來(lái)，這樣就真的合成重組的DNA分子了? 實(shí)際還不夠,還需要DNA連接酶進(jìn)行連接。思考與探究第19頁(yè)，共33頁(yè)。ATGCATGC連接酶連接磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用過(guò)程：二、分子縫合針DNA連接酶第20頁(yè)，共33頁(yè)。作用部位：是磷酸二酯鍵（扶手）不是氫鍵（梯子） DNA連接酶將兩條DNA鏈連接起來(lái)的酶。第21頁(yè)，共

7、33頁(yè)。類型EcoliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別連接酶種類：第22頁(yè)，共33頁(yè)。兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！第23頁(yè)，共33頁(yè)。DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低DNA連接酶的縫合作用第24頁(yè)，共33頁(yè)。A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA

8、聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用第25頁(yè)，共33頁(yè)。DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象 作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵第26頁(yè)，共33頁(yè)。1、外源基因(如抗蟲(chóng)基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如 棉花細(xì)胞)？“分子運(yùn)輸車”載體。2、載體的作用有哪些？作用一：作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲(chóng)基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。作用二：利用載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)

9、，對(duì)外源基因(抗蟲(chóng)基因)進(jìn)行大量復(fù)制。（隨載體的復(fù)制而復(fù)制）三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體第27頁(yè)，共33頁(yè)。“分子運(yùn)輸車”載體常用的載體主要有兩類： 1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒原理：病毒，細(xì)菌等的侵染性。第28頁(yè)，共33頁(yè)。認(rèn)識(shí)常用的載體質(zhì)粒 質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌和酵母菌體內(nèi)。 質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于染色體或細(xì)菌擬核之外，能自我復(fù)制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。第29頁(yè)，共33頁(yè)。質(zhì)粒的特點(diǎn)：1、細(xì)菌染色體外雙鏈環(huán)狀DNA分子2、能自我復(fù)制并在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在3、有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)4、有特殊的遺傳標(biāo)記基因第30頁(yè)，共33頁(yè)。議一議2、能否用SARS病毒作為基因載體？3、作為載體，若沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？4、攜帶目的基因的載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，如何鑒定？5、假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制，將怎樣？1、從化學(xué)組成來(lái)看，載體應(yīng)含有什么成分？雙鏈DNA不能不能進(jìn)行DNA的重組載體上應(yīng)有標(biāo)記基因可能造成基因丟失第31頁(yè)，共33頁(yè)。1）能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。4）必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害。5）大小應(yīng)適合，便于提取和操作 作為運(yùn)載體的必要條件注意：真正用作運(yùn)載體的質(zhì)粒都是人工改造過(guò)的第32頁(yè)，共33頁(yè)。小結(jié)：