45份菜用大黃的SRAP標記引物篩選及親緣關系分析

1、 45份菜用大黃的SRAP標記引物篩選及親緣關系分析 邵珠田+姜立娜+郭小菲+蔡祖國+趙一鵬Summary：以45份引種的菜用大黃遺傳背景未知為出發(fā)點，利用已報道的相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）引物，對這些引種材料進行遺傳多樣性分析，旨在闡明這些材料的親緣關系。結果表明：在選用的182對引物組合中有42對引物擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性較好，可以用作菜用大黃遺傳多樣性分析；利用42對引物對45份材料擴增后共獲得230個等位基因位點，其中多態(tài)性位點202個，平均多態(tài)性位點比例達到878%。基于非加權組平均法（u

2、nweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）的聚類分析結果表明：45份菜用大黃材料聚為7類，雖然來源地相同的大部分種群可以聚在同一個類群內(nèi)，但種群間存在遺傳交叉現(xiàn)象，揭示了種群間的親緣關系，為這些引入材料的進一步利用提供了參考。Key：菜用大黃；SRAP分子標記；引物篩選；親緣關系： S644.903文獻標志碼： A：1002-1302（2017）17-0039-03通信作者：趙一鵬，博士，教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與育種研究。E-mail：。菜用大黃（Rheum rhaponticum L.）別稱食用大黃、圓葉大黃、

3、酸菜等，為蓼科（Polygonaceae）大黃屬（Rheum）中以葉柄為蔬菜的栽培種，英文統(tǒng)稱為Rhubarb。菜用大黃屬于多年生草本植物，其葉柄具有粗大多汁、營養(yǎng)豐富、氣味清新芬芳、風味獨特、口感微酸等特點，是理想的芳香保健類蔬菜。在國外，菜用大黃被廣泛用于制作餡餅、果醬、果凍、面包、蛋糕、沙拉、大黃果酒等各類甜品及加工成高級果蔬汁飲料1-4。目前，國內(nèi)對大黃屬植物的研究和開發(fā)利用僅限于藥用大黃相關資源，對菜用大黃的系統(tǒng)研究較少。2004年以來，河南科技學院菜用大黃引種及種質(zhì)資源利用課題組趙一鵬博士在與國外合作的基礎上，首次開展了菜用大黃優(yōu)良種質(zhì)資源的引種、組織培養(yǎng)技術3-6、栽培學特性及營

4、養(yǎng)成分分析7、根尖染色體觀察及核型分析8等研究，但關于菜用大黃起源、資源親緣關系的研究尚未開展。本研究在進行了相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）體系優(yōu)化的基礎上9，利用多態(tài)性高的42對引物組合對從國內(nèi)外收集到的45份菜用大黃材料進行親緣關系分析，旨在了解這些菜用大黃材料的遺傳背景，為今后菜用大黃優(yōu)良品種選育和分子生物學研究提供一定的技術支持。1材料與方法1.1 材料用于引物篩選的菜用大黃材料為樣本4號，種子來源于美國。用于親緣關系分析的45份材料，采自河南科技學院菜用大黃資源圃，其中從美國引種材料13份，分別編號為

5、113；從英國引種材料20份，分別編號為1428、4145；從北京引種材料12份，分別編號為2940。于2016年4月上旬采集新鮮、無病蟲害的葉片，用清水沖洗干凈，置于-80 冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2方法1.2.1模板DNA的提取及質(zhì)量檢測基因組DNA提取參照Liu等改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法10，用Eppendorf核酸蛋白測定儀（德國）檢測所提DNA的純度及濃度，并用無菌ddH2O稀釋至10 ng/L，-20 保存?zhèn)溆谩?.2.2SRAP-PCR引物的篩選SRAP-PCR擴增程序參照陳萬勝等的方法11，即94 5 min；94 45 s，35 45 s，72 1 min，5個循環(huán)

6、；94 45 s，52 45 s，72 1 min，35個循環(huán)；72 10 min。PCR產(chǎn)物于4 保存?zhèn)溆谩２擞么簏SSRAP-PCR反應體系為筆者所在課題組郭小菲等已優(yōu)化的體系9，即25L體系中包含2.50 L 10PCR Buffer、30 ng模板DNA、2.50 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.04 U/L Taq DNA聚合酶，各0.50 mol/L上下游引物，剩余體積用雙蒸水補足。以上試劑均購自TaKaRa公司。引物序列參考Li等的報道12-15，共選用14條正向引物、13條反向引物（表1），可組合成182對引物。利用4號材料對上述引物進行篩選。依據(jù)

7、電泳結果，選擇擴增產(chǎn)物多態(tài)性豐富、條帶清晰、重復性好的引物組合進行菜用大黃的親緣關系研究。1.2.3PCR擴增產(chǎn)物的檢測擴增反應結束后，在產(chǎn)物中加入5 L 6Loading Buffer，混勻，取2.5 L混合液上樣于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中。預電泳電壓90 V，時間 30 min；電泳電壓120 V，時間3 h。電泳結束后的膠板采用袁菊紅等的銀染法16進行染色。1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析根據(jù)電泳結果，在凝膠相同遷移位置上，擴增有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，最終組成1個由45份材料和所有擴增位點等位基因組成的“1，0”矩陣。利用NTsys-pc Version 2.10e 軟件，采用非加

8、權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）2結果與分析2.1SRAP-PCR引物的篩選及擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析從182對引物中共篩選出擴增產(chǎn)物重復性好、多態(tài)性高和條帶清晰的引物組合42對，圖1為部分引物篩選擴增結果。應用篩選的42對多態(tài)性引物組合對45份材料模板DNA樣品進行PCR擴增，結果共獲得230個等位基因位點，其中202個為多態(tài)性位點。每個引物組合的多態(tài)性比率在16.7%1000%之間，平均多態(tài)性比例達到87.8%；平均每對引物擴增條帶數(shù)5.5個，平均多態(tài)性條帶數(shù)4.8個；在42對引物中，引物組合E1

9、-M4擴增條帶數(shù)最多，共11個，E12-M4組合擴增條帶數(shù)最少，只有1個（表2）。引物組合E1-M4的擴增結果如圖2所示。 2.2菜用大黃遺傳相似性與聚類分析45份樣品經(jīng)NTSYS軟件聚類分析結果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.68處可將45份樣品聚為7類，第1類是34號、35號，種子來源于北京；第2類是25號、26號、27號、28號，種子來源于英國；第3類為36號、37號，種子同樣來源于北京；第4類有13號、15號、38號、39號、40號、42號6個樣品；第5類為2號、3號、4號、8號、10號、11號、12號和24號共8個樣品，除24號來源于英國外，其余均引種于美國；1號單獨聚為1類，引種地為美國，

10、其余22個樣品聚為一大類；45份樣品間的遺傳相似系數(shù)在0.514 90.811 9之間，遺傳距離在0.117 10.703 0之間（圖3）。3討論形態(tài)標記是植物分類學上最古老、最簡便易行的方法，但是由于數(shù)量性狀的遺傳機制復雜、遺傳力低、容易受到環(huán)境因素的影響、工作量大等因素，該方法不能完全滿足親緣關系研究的需要。SRAP標記是一種基于PCR的DNA分子標記技術，具有操作簡單、引物通用性與多態(tài)性高、重復性好、標記位點在基因組中分布均勻等優(yōu)點18。近年來利用SRAP標記技術進行品種鑒定，分析種質(zhì)間的遺傳多樣性、品種間的親緣關系等已經(jīng)有了較多報道19-21。但在關于大黃屬植物的研究中， 僅見陳大霞等

11、利用SRAP標記對正品大黃的遺傳關系進行了分析，其研究結果表明，3種正品大黃間的SRAP的多態(tài)性比例為73.2%22。而本研究中菜用大黃多態(tài)性比例為87.8%，多態(tài)性相對較高，筆者認為與本研究的供試材料來源地有關，因為45份菜用大黃材料來源于北京、美國、英國等不同地區(qū)，遺傳基礎相差較遠，導致變異位點較多。從本試驗結果來看，SRAP分子標記可以成為一種評價種質(zhì)資源親緣關系的新技術。運用SRAP分子標記技術對45份菜用大黃材料進行親緣關系研究，從遺傳相似系數(shù)和聚類樹狀圖來看，個體間存在較大的差異。在遺傳相似系數(shù)0.68處可將供試的45份菜用大黃樣品聚為7類，第1類是34號、35號，種子來源于北京，

12、結果期種子均呈現(xiàn)黃綠色，葉柄表面有短毛、粗糙且斑點密布；第2類是25號、26號、27號、28號，種子來源于英國，葉柄基部均呈現(xiàn)深粉色，表面較為光滑；第3類為36號、37號，引種于北京，結果期種子翅緣均呈現(xiàn)粉紅色。雖然來源地相同的大部分樣品可以聚在同一個類群內(nèi)，但仍出現(xiàn)了交叉聚類現(xiàn)象。24號種子來源于英國，卻與來源于美國的2號、3號、4號、8號、10號、11號、12號種子聚在了第5類；13號、15號種子又與來源于北京的38號、39號、40號種子聚在了第4類。出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于長期的選擇進化及不斷的相互引種，導致各生態(tài)地理群之間種質(zhì)的相互滲透。本研究通過SRAP標記技術對收集到的45份國

13、內(nèi)外菜用大黃材料進行了初步的親緣關系分析，為今后進行菜用大黃遺傳育種和品種鑒定提供了一定的技術支持。Reference：1盧莉，趙一鵬. 菜用大黃的研究進展J. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2008（2）：19-21，27.2Zhao Y P. Somaclonal variation and crop failure of micro-propagated rhubarbD. Colchester，UK：University of Essex，2004.3盧莉，趙一鵬，蔡祖國，等. 歐洲大黃種子發(fā)芽特性研究J. 種子，2007，26（3）：35-37.4趙一鵬，Grout B W，周巖. 歐洲大黃莖尖組織

14、培養(yǎng)與快速繁殖J. 河南職業(yè)技術師范學院學報，2004，32（3）：24-25，28.5盧莉. 菜用大黃的種子萌發(fā)特性與離體快繁技術研究D. 新鄉(xiāng)：河南師范大學，2008.6張有鐸，蔡祖國，趙一鵬. 菜用大黃組培苗生根特性研究J. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48（11）：2759-2761.7吳亞蓓. 菜用大黃栽培學特性與營養(yǎng)成分分析D. 新鄉(xiāng)：河南科技學院，2012.8任文娟，郭小菲，姜立娜，等. 菜用大黃染色體制片優(yōu)化及核型分析J. 華北農(nóng)學報，2013，28（5）：128-132.9郭小菲，姜立娜，蔡祖國，等. 菜用大黃 SRAP-PCR 反應體系的優(yōu)化及驗證J. 華北農(nóng)學報，2014，2

15、9（4）：105-110.10Liu L，Guo W，Zhu X，et al. Inheritance and fine mapping of fertility restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L.J. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：461-469.11陳萬勝，王元英，羅成剛，等. 利用正交設計優(yōu)化煙草SRAP反應體系J. 分子植物育種，2008，6（1）：177-182.12Li G，Quiros C F. Sequence-rela

16、ted amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in BrassicaJ. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.13Ferriol M，Pic B，Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and

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