基因表達調(diào)控課件

1、第二十二章基因表達調(diào)控 概 述一、基因（gene)(一)概念 基因 是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是指貯存有功能的蛋白質多肽鏈或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列.（二）分類 基因可以分為結構基因和調(diào)節(jié)基因。結構基因（structural gene） 指能轉錄成為mRNA、rRNA或tRNA的DNA順序。二、基因表達（gene expression）（里外）（一）概念 基因產(chǎn)生功能的過程，稱基因表達，也稱編碼（code）。 DNA RNA protein基因表達的過程是信息分子（DNA或RNA）轉變成功能分子（protein）的過程。這一過程在體內(nèi)受到精密的調(diào)控，以保證功

2、能的有序性。這一調(diào)控稱為基因表達的調(diào)控，簡稱基因調(diào)控。mRNAtRNArRNAtranscriptiontranslationreplicationreverse transcription三、基因表達調(diào)控的要點（了解）原核生物真核生物無真核結構的單細胞生物。包括細菌、藍綠藻等。其DNA、protein、組成1個相當致密的類核，但無核膜與胞質分開。因為無核膜，基因受環(huán)境影響大。單或多細胞生物，有核膜將染色體等有關物質包圍在內(nèi)與胞質分開，細胞有有絲分裂和減數(shù)分裂2種形式，具有這些特征的生物稱真核生物。其細胞稱為真核細胞。(一)調(diào)控的細胞學基礎（二）調(diào)控最大特點 調(diào)控直接受環(huán)境及營養(yǎng)狀況的影響。調(diào)

3、控是為了適應環(huán)境獲取營養(yǎng)達到生存即分裂繁殖的最優(yōu)化（原核既無充足的能源貯備，又無高等植物制造有機物的本領）。所以調(diào)控體現(xiàn)1個“快”字，快速適應環(huán)境，獲取營養(yǎng)，合成必需蛋白質、降解不必要成分。這是長期進化，獲得的適應應變能力。激素水平和發(fā)育階段是基因表達調(diào)控的最主要手段。遺傳程序調(diào)控、按“既定方針辦”如動物1個受精卵，按遺傳程序開開關關基因，發(fā)育成成熟個體，該遺傳程序是構成胚胎發(fā)育和組織分化的基礎。僅極少基因間接或直接受環(huán)境因素的影響。這一特點使真核在千變?nèi)f化的環(huán)境下，主要組織或器官仍能維持正常功能。（三）調(diào)控主要水平 真原核調(diào)控的主要水平（主調(diào)）都在轉錄水平。因為：1.任何連鎖反應控制第一步是

4、最經(jīng)濟和最有效的（既不需要，何必轉錄）。2.RNA pol 沒有糾錯功能（DNA pol 有）微調(diào) DNA水平 轉錄后水平 原核調(diào)控余步不大，因其轉錄翻譯同一個compt進行。 翻譯水平 是原核次要調(diào)控水平。 翻譯后水平（四）調(diào)控的基本方式 真原核調(diào)控的基本方式都是通過調(diào)控因子：1.蛋白質（主）2.核酸 和 3.小分子化合物之間的識別和相互作用對基因表達實現(xiàn)正控制或負控制（也稱正調(diào)控和負調(diào)控）。 （五）調(diào)控物質的化學本質 蛋白質、核酸、小分子化合物。（六）調(diào)控模式 原核有操縱子調(diào)控模型，已發(fā)現(xiàn)100多種。真核有Britten-Davidsen（法）模型尚未為實驗所證實。 病毒基因表達調(diào)控 各種

5、病毒、噬菌體等除部分帶有RNA pol或逆轉錄酶外主要是利用宿主的基因表達調(diào)控系統(tǒng)。原核病毒適應原核生物遺傳策略，真核病毒適應真核生物遺傳策略。（七）基因表達的時間性和空間性 （1）時間特異性：按功能需要，某一特定基因表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性。 （2）空間特異性：在個體生過程中，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，這實際是由細胞在器官的分布決定的，因此又稱細胞特異性或組織特異性。（八）基因表達的方式 （1）組成性的基因表達：細胞對不同蛋白質的需要是不一樣的，一些基因產(chǎn)物對生命全過程都是必需的，這類基因的表達水平在所有細胞或組織中幾乎是不變

6、的，如三羧酸循環(huán)這個中心代謝途徑的酶類，它們的基因表達就屬于這一類，這類基因稱為管家基因（house keeping gene）。這類穩(wěn)定的幾乎不用調(diào)節(jié)的表達方式稱為組成性的基因表達或基本性的表達（constitute expression）。 （2）誘導和阻遏表達：某些基因表達產(chǎn)物數(shù)量隨著外界環(huán)境信號變化而變化，這類基因稱為調(diào)節(jié)基因。有些基因對環(huán)境信號應答時被激活，基因表達增加的過程稱為誘導（indution），被誘導才表達的基因稱為可誘導基因（inducible genes），反過來有些基因對環(huán)境信號應答時被抑制，基因表達產(chǎn)物水平降低，這種基因表達方式稱為阻遏，這類基因稱作可阻遏基因。例如

7、，當色氨酸供給豐富的情況下，細菌中有關色氨酸合成酶的基因表達就會受到阻遏。 原核生物基因表達的調(diào)控 從調(diào)控方式來看，原核生物調(diào)控最重要的特點是操縱子模式。 從調(diào)控水平來看，主調(diào)在轉錄水平，翻譯水平次之。如果每個基因等同翻譯，每一個多肽應有相同的拷貝數(shù)。結論是否定的，基因的表達是被控制的。有些蛋白質的數(shù)目相當固定，另一些則變化很大。一種是組成性、固定的：50種核糖體蛋白數(shù)量十分穩(wěn)定。糖酵解體系的酶數(shù)目也極恒定。DNA聚合酶、RNA聚合酶等代謝過程中十分必需的酶或蛋白質（組成型合成蛋白）的合成速率不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響。而另一種類型則被稱為適應型或調(diào)節(jié)型(adaptive or regula

8、ted)，這類蛋白質的合成速率明顯地受環(huán)境的影響而改變。例如，一般情況下，一個大腸桿菌細胞中只有15個分子的-半乳糖苷酶，但若將細胞培養(yǎng)在只含乳糖的培養(yǎng)基中，每個細胞中這個酶的量可高達幾萬個分子。其他參與糖代謝的酶，氨基酸、核苷酸合成系統(tǒng)的酶類，其合成速度和總量都隨培養(yǎng)條件的變化而改變。一、 原核基因表達調(diào)控總論細菌中的基本調(diào)控機制有如下規(guī)律:一個體系在需要時被打開，不需要時被關閉。這種“開-關”(on-off)活性是通過調(diào)節(jié)轉錄來建立的，即通過調(diào)節(jié)mRNA的合成來實現(xiàn)的。一個系統(tǒng)處于“off”狀態(tài)時可能是本底水平的基因表達，常常是每世代每個細胞合成12個mRNA分子和極少量的蛋白質分子。必須

9、明白所謂“關”實際的意思是基因表達量特別低，或者無法檢測。原核基因表達調(diào)控的基本類型： 1、轉錄水平的調(diào)控 起始階段-主要 延伸階段-通常不受調(diào)控 終止階段-可能受到調(diào)控2、翻譯水平的調(diào)控 主要發(fā)生在起始和終止階段二、操縱子(operon) 1961年 Jacob and Monod -乳糖操縱子模型 細菌轉錄調(diào)控的最初概念（一） 概念： 在原核生物中，若干結構基因可串聯(lián)在一起，其表達受到同一調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控，這種基因的組織形式稱為操縱子。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI（二）類型與結構 不同的操縱子結構區(qū)（結構基因串）不同，調(diào)控區(qū)（P-O）也不一樣，因而調(diào)控的方式也不

10、完全相同，據(jù)操縱子對于能調(diào)節(jié)它們表達的小分子應答的性質可將操縱子分為二大類。（1）可誘導的操縱子(inciduble operon)加入調(diào)節(jié)小分子開啟基因轉錄活性，這種作用及其過程稱誘導(induction)產(chǎn)生誘導作用的小分子稱誘導物(inducer)。誘導物一般為操縱子編碼的酶蛋白分解的底物。如：乳糖操縱子（乳糖）。（2）可阻遇的操縱子(repressible operon)加入調(diào)節(jié)小分子，關閉基因轉錄活性這種作用及過程稱阻遏(repression)，產(chǎn)生阻遏的小分子物質稱輔阻遏物(corepressor)。輔阻遏物一般為操縱子編碼的酶合成的物質（產(chǎn)物）如：色氨酸操縱子（色氨酸）。（三）操

11、縱子(operon)的基本組成結構基因、調(diào)節(jié)基因、操縱元件（操縱基因）、啟動子、終止子lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacIlacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI三、乳糖操縱子（一）組成：5種元件由1個調(diào)節(jié)基因，3個結構基因、操縱基因（控制元件）、啟動子和終止子組成。1、結構基因（1）lacZ：編碼b 半乳糖苷酶 （使乳糖水解）（2）lacY：編碼b 半乳糖苷透過酶 （使b 半乳糖苷透過細胞壁、質膜進入細胞內(nèi)）（3）lacA：編碼b 半乳糖苷乙酰轉移酶 （將乙?；D移到b 半乳糖苷上）2、啟動子： Plac：控制 lacZ, lacY, lacA；多順反

12、子的mRNA3、終止子4、調(diào)節(jié)基因lacI：編碼阻遏蛋白（repressive protein）亞基 四聚體存在時具有活性，與 Olac具有 很強的親和力lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI5、控制元件 操縱基因Olac （1）28bp的回文結構，可形成十字形結構 （2）這種結構正好與由四個相同亞基組成的阻遏 蛋白相匹配。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacIPlac / RNA polymeraseOlac / repressor-50-30-1010130-20-4020mRNAstartpoint（二）乳糖操縱子的負調(diào)控培養(yǎng)基不含乳糖 lacZ、

13、 lacY 、 lacA低表達（二）乳糖操縱子的負調(diào)控1、阻遏蛋白與操縱基因結合2、阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結合 3、轉錄不能進行4、lacZ， lacY 、lacA低表達lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA Inducer（異構乳糖）lactose分解lactose（三）乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)培養(yǎng)基含乳糖 -lacZ 等高表達（三）乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)1、阻遏蛋白與異構乳糖結合2、阻遏蛋白構象變化，不能與操縱子序列結合3、RNA聚合酶與lac啟動子結合4、lacZ， lacY ， lacA的轉錄可順利進行本底水平的組成性表達無誘導物存在時仍有少

14、量lac mRNA合成五、色氨酸操縱子（了解）調(diào)節(jié)基因（一）組成1、結構基因（1）基因E、D、C、B、A（2）編碼色氨酸合成所需要酶類 （3）頭尾相接串連排列組成結構基因群（4）組成一個轉錄單元（5）多順反子mRNA2、調(diào)節(jié)基因trpR（1）位置:遠離P-結構基因群（2）編碼調(diào)控蛋白R（3）R沒有與操縱元件結合的活性（4）當環(huán)境能提供足夠濃度的色氨酸時，R與色氨酸結合后構象變化而活化（5）R與特異性結合，抑制結構基因的轉錄3、操縱元件（1）18bp的回文結構（2）與色氨酸啟動子Ptrp序列在21 and +3 堿基之間重疊（3）與Trp-R特異性結合，阻遏結構基因的轉錄現(xiàn)象：培養(yǎng)基中Trp 濃

15、度較低時- 基因E、D、C、B、A高表達 Trp 濃度較高時- 基因E、D、C、B、A低表達（二）色氨酸操縱子與轉錄調(diào)控Trp操縱元與負控阻遏系統(tǒng)1、Trp操縱子與負控阻遏系統(tǒng)（一）（1）培養(yǎng)基中Trp 濃度較低（2）調(diào)控蛋白R不能被活化（3）未活化的調(diào)控蛋白R不能與操縱元件結合（4）基因E、D、C、B、A高表達Trp操縱元與負控阻遏系統(tǒng)Trp2、Trp操縱子與負控阻遏系統(tǒng)（二）（1）培養(yǎng)基中Trp 濃度較高（2）調(diào)控蛋白R與Trp結合（3）Trp-R復合物與操縱子結合（4）基因E、D、C、B、A低表達（三）色氨酸操縱元總結1、通常是開放轉錄的，有效應物（色氨酸為阻遏物）作用時則阻遏關閉轉錄。

16、2、負性調(diào)控的、可阻遏的操縱子3、色氨酸可以作為共阻抑物起作用，并通過終產(chǎn)物抑制自身的合成（負反饋調(diào)節(jié)）。4、細菌不少生物合成系統(tǒng)的操縱子都屬于這種類型，其調(diào)控可使細菌處在生存繁殖最經(jīng)濟最節(jié)省的狀態(tài)。實驗觀察表明： 當色氨酸達到一定濃度、但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產(chǎn)生色氨酸合成酶類的量已經(jīng)明顯降低，而且產(chǎn)生的酶量與色氨酸濃度呈負相關。這種調(diào)控現(xiàn)象與色氨酸操縱子特殊的結構-衰減子有關。一、特點 1、多層次 2、無操縱子和衰減子 3、個體發(fā)育復雜 4、受環(huán)境影響較小激素水平和發(fā)育階段是基因表達調(diào)控的最主要手段， 其調(diào)控最大特點是遺傳程序調(diào)控。 真核生物基因表達的調(diào)控二、真核生物

17、基因表達調(diào)控的層次：1、DNA水平調(diào)節(jié)2、 轉錄水平調(diào)節(jié)3、轉錄后水平的調(diào)節(jié)4、翻譯水平調(diào)節(jié)5、翻譯后加工的調(diào)節(jié)DNA轉錄初產(chǎn)物RNAmRNA蛋白質前體mRNA降解物活性蛋白質DNA水平調(diào)節(jié)轉錄水平調(diào)節(jié)轉錄后水平的調(diào)節(jié)翻譯調(diào)節(jié)mRNA降解的調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)核細胞質調(diào)控主要水平是轉錄水平。其次為轉錄后水平、DNA水平、翻譯及翻譯后水平等。第二十三章重組DNA技術 一、重組DNA（ 基因克隆、分子克?。?通過體外重組技術,將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程?；蚩寺〉暮诵?體外重組(Recombination) 人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。載體DNA（vector）目的DNA（target fragment）重組DNA（recombinant DNA ）宿主（host）篩選、擴增克?。╟lone）二、DNA克隆的路線DNA 重組轉化重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉化受體細胞，并能在受體細胞中復制和遺傳；（4）對轉化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺