如何做好免疫印跡

1、關(guān)于如何做好免疫印跡第一張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月印記法印跡（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用探測物特異性檢測未知樣品的方法。1975年，Southern將DNA轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素（NC）膜上，并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段，后來稱這種方法為Southern印跡法。第二張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月印記法Southern BlotNorthern BlotWestern BlotFar Western BlotDot Blot？DNARNAProtein第三張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Western-blot高靈敏度、

2、高特異性的蛋白檢測應(yīng)用于絕大多數(shù)生物、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室成熟的技術(shù)、豐富的方案選擇第四張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月主要步驟樣品制備電泳轉(zhuǎn)膜封閉結(jié)合抗體發(fā)光（顯色）信號檢測第五張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品制備細(xì)胞裂解蛋白溶解（可一步完成）蛋白定量第六張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞裂解離子型去垢劑（SDS）非離子型去垢劑（N-P40，TritonX-100）Tris、NaCl、疊氮化鈉、正釩酸鈉等蛋白酶抑制劑 EDTA、PMSF、PI cocktail等超聲研磨勻漿反復(fù)凍融第七張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Laemmli Sample Buff.

3、(161-0737 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% b-ME, 25%Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 變性蛋白Native Sample Buff.(161-0738 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 非變性蛋白35mm小盤：250ml 30mm中盤：500ml100mm大盤：1ml檢測磷酸化蛋白：再加入Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM 樣品制備緩沖液Tricine Sample Buff.(161-0

4、739 30ml)200mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 40% Glycerol, 0.04% Coomassie blue 多肽第八張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白的定量用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三種方法，其中A280法靈敏度為0.2-2 mg/ml，但核酸可引起強(qiáng)干擾作用；Lowry 法靈敏度為5-100 g/ml，雖相對準(zhǔn)確，但干擾物質(zhì)多且反應(yīng)速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法靈敏度為25-200 g /ml，由于相對干擾物質(zhì)較少，且反應(yīng)時(shí)間僅需2分鐘,故適合用于大多數(shù)研究的蛋白定

5、量。Bio-rad另有對一種適用于去垢劑增溶蛋白樣品的比色測定的試劑盒DC Protein Assay Kit，該方法類似于常規(guī)的Lowry方法，但經(jīng)過改良后，節(jié)省了操作時(shí)間。DC蛋白測定只需要15分鐘的溫育時(shí)間，而且吸收值讀數(shù)保持2小時(shí)的穩(wěn)定。RC DC Protein Assay Kit蛋白測定是一種適用于含還原劑和去垢劑的蛋白測定，具有原來DC蛋白測定的特點(diǎn)，并能與更多的試劑兼容，簡化了復(fù)雜蛋白樣品溶液的定量測定。第九張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月特殊的兼容物 - - Detergent Reducer &. Detergent樣品制備定量第十張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于20

6、22年6月 200800 nm Scanning mode Standard curves Kinetics Direct display PrinterSmartSpec plus SpectrophotometerProtein AssayRC DC Protein Assay Reducing agent compatible Detergent compatible第十一張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月電 泳第十二張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基質(zhì)及交聯(lián)劑基質(zhì)： 丙稀酰胺（Acrylamide）交聯(lián)劑： 第十三張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基質(zhì)及交聯(lián)劑

7、T%C%蛋白SDS常用C：1：29，1：37.5T%的線性分離范圍：T線性分離范圍5572127.53694102080121260151043C=1:29第十四張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月非變性體系1配方積層膠4 A/B, 0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠T A/B, 0.625M Tris-HCl, pH 8.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 40% 甘油, 0.01% 溴酚藍(lán)電極緩沖液25 mM Tris, 192 mM甘氨酸,

8、pH 8.3第十五張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月變性體系1配方積層膠4 A/B, 0.125M Tris-HCl pH 6.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠T A/B, 0.625M Tris-HCl pH 8.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 25% 甘油,0.01% 溴酚藍(lán)電極緩沖液25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 0.1% SDS, pH 8.3第十六張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月適合小分子

9、蛋白分離的Tris-Tricine 體系1配方積層膠4 A/B, 0.745M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠10 A/B*, 1M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液200mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 40% 甘油, 0.04% 考馬斯亮藍(lán)G-250電極緩沖液100mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1% SDS*建議選用C%=2.6%*可將陽極緩沖液換成0.2M Tris, 0.1% SDS第十七張，PPT共五十

10、五頁，創(chuàng)作于2022年6月預(yù)混電泳緩沖液Premixed Electrophoresis Buffers161-0732 10 x Tris/Glycine/SDS, 1 L161-0772 10 x Tris/Glycine/SDS, 5 L cube161-0734 10 x Tris/Glycine, 1 L161-0771 10 x Tris/Glycine, 5 L cube161-0744 10 x Tris/Tricine/SDS, 1 L第十八張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月SDS主要設(shè)備第十九張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Precision Plus P

11、roteinTM 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 條帶窄而清晰，分子量準(zhǔn)確（經(jīng)質(zhì)譜驗(yàn)證），可用于蛋白分子量測算；未預(yù)染的條帶標(biāo)記鏈親和素(Streptavidin)親和肽，可進(jìn)行Western雜交檢測；包括未預(yù)染(161-0363)，預(yù)染全藍(lán)(161-0373)，雙色(161-0374)和彩染(161-0375)每種標(biāo)準(zhǔn)品含10個(gè)條帶，跨度從10KD250KD。第二十張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月未染標(biāo)準(zhǔn)品分子量測定Fig. 1. Approach for MW determination of an unknown protein. Lane 1, 10 l of Precision Plus Pr

12、otein unstained standards; lanes 27, a dilution series of an E. coli lysate containing a hypothetically unknown protein (GFP). Proteins were separated by Criterion 420% Tris-HCl gel and stained with Bio-Safe Coomassie stain. 第二十一張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Precision Plus ProteinTM 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品r20.996第二十二張，PPT共五十五

13、頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn) 印第二十三張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月印跡膜硝酸纖維素(NC)膜：歷史悠久，蛋白結(jié)合力不強(qiáng)，載量較低Nitrocellulose:載量80-100mg/cm2，孔徑0.2/0.45 mm聚偏四氟乙烯(PVDF)膜：蛋白結(jié)合力強(qiáng)，載量較大，使用廣泛Immuno-BlotTM :載量150-160mg/cm2，適于反復(fù)洗脫。孔徑0.2mmSequi-BlotTM ：載量170-200mg/cm2，蛋白結(jié)合更牢固，可用于蛋白測序或小分子轉(zhuǎn)印，孔徑0.2mm尼龍(Nylon)膜: 帶正電荷，結(jié)合力最強(qiáng)，載量最大，尤其適于很小分子轉(zhuǎn)印和生物素顯色 Zeta-Pr

14、obe: 載量480mg/cm2，蛋白結(jié)合最牢固，封閉只需5脫脂奶粉第二十四張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月緩沖液Towbin 緩沖液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇.Towbin緩沖液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇.CAPS緩沖液: 10mM CAPS, 10%甲醇.乙酸緩沖液: 0.7%乙酸第二十五張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月不同蛋白須用不同緩沖體系和膜蛋白測序Towbin,CAPSNC,PVDF高分子蛋白Towbin-SDS,CAPSNC,pH!小分子蛋白或肽

15、Towbin,CAPSNC,PVDF堿性蛋白(pI9)在SDSCAPS,碳酸-Bjerrum S-NielsenNC,PVDF堿性蛋白(pI9)在native0.7% HACNC,PVDF糖蛋白Towbin,CAPS-SDS/-,碳酸鹽, Bjerrum ,S-NielsenNC,PVDFproteoglycansTowbin, Bjerrum ,S-NielsenNC,PVDF第二十六張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（濕轉(zhuǎn)）Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽2. Criterion轉(zhuǎn)印儀Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽Trans-Blot Plus轉(zhuǎn)印槽半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)Tra

16、ns-Blot SD 半干轉(zhuǎn)印槽微量過濾及篩選系統(tǒng)Bio-Dot 和 Bio-Dot 微量過濾器Mini-Protean II多道篩選儀真空轉(zhuǎn)印系統(tǒng)785 型真空轉(zhuǎn)印儀 (DNA & RNA 轉(zhuǎn)印至尼龍膜)轉(zhuǎn)印設(shè)備電 轉(zhuǎn) 印第二十七張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月電轉(zhuǎn)印+-Anode Membrane Gel Cathode電場強(qiáng)度決定轉(zhuǎn)印的效率 場強(qiáng)越高，轉(zhuǎn)印越快電場強(qiáng)度又取決于電極間距離距離越短，場強(qiáng)越高.第二十八張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月半干轉(zhuǎn)印特有的不連續(xù)轉(zhuǎn)印緩沖液被隔絕，允許正、負(fù)極間緩沖液不同陰極(膠面)緩沖液含0.1%SDS，不含甲醇，利于轉(zhuǎn)印陽極(膜面

17、)緩沖液不含SDS，含20甲醇，防止轉(zhuǎn)過配合PVDF膜可提高轉(zhuǎn)膜效率，減少損失第二十九張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月*5儲液：36.34 g Tris, 44.26 g CAPS, 加水至 1 L一個(gè)新型不連續(xù)轉(zhuǎn)膜體系緩沖液：1.5mA/cm2 (電壓不超過25V)，轉(zhuǎn)印30-60min陰極緩沖液陽極緩沖液5Tris-CAPS儲液*20ml20ml10% SDS1ml-Methanol-15mlH2O79ml65ml第三十張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月巧妙的改進(jìn)，出色的結(jié)果 左：10%SDS PAGE后用前述不連續(xù)緩沖體系半干轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印后印跡膜用考馬斯藍(lán)R250染色；中

18、：轉(zhuǎn)膜后凝膠考染；右：Western Blot檢測該印跡膜上p47蛋白。泳道1、2分別為Kaleidoscope 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞全蛋白 1 2 1 2 216kD132kD第三十一張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月特殊轉(zhuǎn)印要求下儀器和試劑的選擇應(yīng)用轉(zhuǎn)印緩沖液印跡膜推薦儀器蛋白測序CAPSPVDF/NC槽式轉(zhuǎn)印大分子蛋白Towbin with SDS, 不連續(xù)體系PVDF/NC槽式轉(zhuǎn)印小分子蛋白或多肽Towbin，CAPSPVDF槽式轉(zhuǎn)印堿性(pI9), 變性膠CAPSNC/PVDF槽式/半干轉(zhuǎn)印堿性(pI9), 非變性膠0.7% 乙酸NC/PVDF槽式轉(zhuǎn)印糖蛋白Towbin(with

19、 SDS), CAPSNC/PVDF槽式/半干轉(zhuǎn)印蛋白多糖TowbinNC/PVDF槽式/半干轉(zhuǎn)印第三十二張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月兩種轉(zhuǎn)印系統(tǒng)的比較半干轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)每塊mini膠所需緩沖液的量20ml500700ml所需時(shí)間30分鐘(大分子量蛋白應(yīng)適當(dāng)延長)3060分鐘(很大分子量蛋白適當(dāng)延長)冰浴不需要需要適用范圍150KD無限制第三十三張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月電壓,電流,功率設(shè)置恒電壓時(shí),電阻下降,電流加大,會產(chǎn)高熱,須降溫(半干除外)設(shè)置恒電流時(shí),電壓和功率隨電阻下降而下降,產(chǎn)熱也會降低,以后隨場強(qiáng)下降,轉(zhuǎn)印速度也會下降.設(shè)置恒功率時(shí),電流隨電阻下降而升高,

20、升高的速度較恒電壓時(shí)低,所以設(shè)置恒功率近似恒電流第三十四張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Semi-dry blotTransfer mini gels for 1530 minutes at 1015 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 1525 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large gels; 5.5 mA/cm2 for mini gels) is recommended t

21、o prevent excessive heating during the run.第三十五張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月濕轉(zhuǎn)第三十六張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月用Bio-Dot 或 Bio-Dot SF進(jìn)行斑點(diǎn)或狹縫印跡直接真空抽濾上樣至印跡膜 方便快速，可高溫消毒，適于高通量篩選第三十九張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)膜后檢測麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的

22、Western印跡過程。 注：染色法不適合蛋白結(jié)合力較強(qiáng)的PVDF膜和尼龍膜第四十張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月封閉目的：封閉膜上多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性反應(yīng)封閉液脫脂奶粉或BSA (5) 溶于TBST (100mmol/L Tris-Cl, 9g/L NaCl, 5g/L Tween 20)溶液中封閉時(shí)間：37一小時(shí)，4過夜第四十一張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月常用封閉液試劑膜濃度備注明膠NC1-3%明膠加熱溶解脫脂奶,BLOTTONC,PVDF0.5-5%PVDF所需濃度要高BSANC,PVDF1-5%PVDF所需濃度要高TWEEN20NC0.05-0.3%

23、可能有雜帶第四十二張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一抗、二抗孵育根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉液配制的一抗液與濾膜溫育。37一小時(shí)，4 過夜倒掉一抗溶液，用TBST液濾膜3次，每次5min加入用封閉液配制的二抗溶液，37一小時(shí)，4過夜倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3-5次，每次10min。第四十三張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月印跡膜檢測第四十四張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十五張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月全蛋白檢測負(fù)離子染色主要有考馬斯亮藍(lán)-R250和氨基黑優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)、快速，缺點(diǎn)：靈敏度低，膜易變形氨基黑染色背景較低，脫色容易，優(yōu)于考馬斯藍(lán)第四十六張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月常用的有Sypro Ruby等靈敏度高(2-8ng)，線性范圍寬，超過1000倍可用于蛋白測序等價(jià)格相對昂貴，需要UV成像儀或激光掃描儀全蛋白檢測熒光染色第四十七張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十八張，PPT共五十五頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)發(fā)光底物被HRP或AP分解后發(fā)光，被X光片或成像系統(tǒng)檢測Immuno-StarTM HRP a.13pg的靈敏度b.信號持續(xù)時(shí)間長達(dá)6-8小時(shí)c.曝光時(shí)間短：30Immuno-StarTM AP a.超長的信號持續(xù)時(shí)間：24小時(shí)b.數(shù)星期后，