-北京林業(yè)大學(xué)植物組織培養(yǎng)思考題答案

1、思考題 1外植體： 由活體（ivivo)植物體上提取下來的，接種在人工培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、器官等。組織培養(yǎng)：將離體(invitro)的植物器官、組織、或細(xì)胞,在無菌條件下,利用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植株的過程。培養(yǎng)基：能滿足植物細(xì)胞生存、增殖、再生所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。主要包括大量/微量無機(jī)元素、維生素、氨基酸、糖類、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（如激素）、固化物、水等愈傷組織：在人工培養(yǎng)的外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞細(xì)胞全能性：植物細(xì)胞具有該植物體全部的遺傳信息，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特

2、有的全套遺傳物質(zhì)，從理論上講，都有發(fā)育成為完整個(gè)體的可能性。分化細(xì)胞：具有特定的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能的細(xì)胞脫分化：將已分化的、已停止分裂的組織細(xì)胞從植物體的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂、分化活性人工種子：植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生與正常合子胚相似的胚狀體(embryoid)，將胚狀體包裹在含有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的包膜中，并在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗，稱為植物人工種子(plant artificial seeds)滅菌：指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死無菌操作：通過嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺(tái)、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任

3、何活著的微生物，稱為無菌操作消毒：指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物。接種：表面滅菌處理后的植物材料，經(jīng)切割分離出器官、組織、細(xì)胞，再經(jīng)無菌操作轉(zhuǎn)接到無菌培養(yǎng)基上的過程，稱接種褐變：在培養(yǎng)過程中，外植體表面顏色逐漸變褐，進(jìn)而整個(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。玻璃化現(xiàn)象：在長期的離體培養(yǎng)過程中，試管苗生長異常，表現(xiàn)為試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透時(shí)， 水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織初代培養(yǎng)：接

4、種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)：繼初代培養(yǎng)之后，營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移外植體到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。定芽：在高等植物正常的個(gè)體發(fā)育中，一般從莖尖或葉腋等一定位置生出芽，如頂芽、腋芽、副芽等，稱為定芽不定芽：從葉、根、或莖節(jié)間等通常不形成芽的部位生出的芽，稱為不定芽胚狀體: 由愈傷組織類似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體.馴化：通過減肥、增光、降溫、控水等措施，提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應(yīng)性，提高光合作用的能力，提高試管苗的移栽成活率。指示植物：有些植物對病毒極為敏感，感染后會(huì)在其葉片乃至全株上表現(xiàn)特殊的病斑脫毒苗：指經(jīng)過莖尖嫁接或熱處

5、理莖尖嫁接后,再采用科學(xué)的方法鑒定確診已不帶上述病毒或類似病毒的苗木為母本,然后采用無病毒繁殖程序培育出來的苗木思考題 2植物組織培養(yǎng)特點(diǎn)培養(yǎng)條件可以人為控制，成活率高組織培養(yǎng)采用的植物材料在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周期性培養(yǎng)生產(chǎn)。生長周期短，繁殖率高根據(jù)不同植物不同部位的不同要求提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快，20-30d 即為一個(gè)周期。植物材料按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但總體來說成本低廉，能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。管理方便，利

6、于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制植物組織培養(yǎng)通過人為提供一定生長條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)，是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕、除草、澆水施肥、防治病蟲害等一系列繁雜勞動(dòng)，大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。不同細(xì)胞潛在全能性（或再生成新個(gè)體的能力）的差異受精卵的全能性最高體細(xì)胞的全能性比分化細(xì)胞的高分生組織細(xì)胞的全能性比分化細(xì)胞的高植物細(xì)胞的全能性高于動(dòng)物細(xì)胞植物組織培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用快速繁殖短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的植株。已成為優(yōu)良品種種苗生產(chǎn)的主要技術(shù)之一 從優(yōu)良母株上去下一小塊組織，一年可以繁殖幾萬到幾百萬個(gè)植株。在花卉育

7、種過程中，不斷的雜交、選種擴(kuò)展了花卉的花形與顏色，但也造成了花卉基因類型的高度異質(zhì)化，子代不易有均一表現(xiàn)。組培苗是在母株器官、組織或細(xì)胞的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可以保持母株的全部特性目前，用組織培養(yǎng)進(jìn)行工廠化育苗已廣泛用于生產(chǎn)專家們預(yù)測，到二十一世紀(jì)中期，果樹、經(jīng)濟(jì)林木、名貴花卉、藥材等苗木將主要通過組織培養(yǎng)來繁殖。種苗脫毒應(yīng)用營養(yǎng)繁殖(塊莖、扦插等）的植物，其病毒病危害相當(dāng)嚴(yán)重。-病毒通過營養(yǎng)體及其刀具、土壤傳遞，大大加速了病毒病的傳播和積累。據(jù)統(tǒng)計(jì)，觀賞植物的病毒已多達(dá) 100 多種。-花少且小、花朵畸形，變色，大大影響觀賞價(jià)值，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致品種的滅絕。 植物組織培養(yǎng)脫毒的原理：莖尖分生組織

8、不帶毒或帶毒少。-感病植株體內(nèi)的病毒分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位和年齡而異，越靠近莖尖頂端的區(qū)域，病毒的濃度也越低。-分生區(qū)域無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，其傳遞速度低于細(xì)胞分裂和生長的速度。通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。已取得成功的有草莓、馬鈴薯、香蕉、生姜等。新品種培育植物細(xì)胞或原生質(zhì)體經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)再生植株的過程中，可能伴隨著廣泛的變異，又稱為體細(xì)胞無性系變異。植物體細(xì)胞無性系變異是遺傳變異的重要來源之一，具有變異廣泛、后代較穩(wěn)定、基本保持原品種特性等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞在離體培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生廣泛的無性系變異，通過協(xié)迫培養(yǎng)，可以獲得具有相應(yīng)耐性的愈傷組織，誘導(dǎo)再生獲得耐性植株

9、。-采用組織培養(yǎng)誘變和篩選具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。-中國林科院用逐步加大培養(yǎng)基中鹽的濃度，直接獲得耐鹽的楊樹株系。遠(yuǎn)緣雜交種后代的獲得：百合、鳶尾等許多花卉雖然可以進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，但是由于生理代謝等方面的原因，常使雜種胚早期敗育，因而得不到雜種植物。而通過胚培養(yǎng)，可使其順利生長，得到遠(yuǎn)緣雜種。-遼寧果樹研究所利用這種方法獲得蘋果與梨的雜交種。物理、化學(xué)誘變處理獲得人工突變體秋水仙素誘導(dǎo)多倍體-以四季桔種子為外植體, 秋水仙素誘導(dǎo)多倍體 變異植株，葉片變大,莖變粗, 氣孔明顯增大，氣孔密度降低.-花卉莖秋水仙素處理，新品種植株粗壯、葉大、花器官增大、花色更嬌艷，如百合、萱草

10、、金魚草、馬蹄蓮、報(bào)春花轉(zhuǎn)基因植物基因工程體系中，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再生。 基因工程包括互相銜接的三個(gè)部分：-目的基因的分離、體外重組；-將外源基因引入受體細(xì)胞并使其轉(zhuǎn)化和植株再生；-鑒定轉(zhuǎn)基因植物表型種植資源保存-有性繁殖會(huì)造成不同程度的基因重組和變異，如紅色可能變異成粉紅色等；組織培養(yǎng)可保持原母本的一切遺傳特性，防止種質(zhì)資源的退化。-頻危品種：增加頻危品種的數(shù)目（熊貓）-無性繁殖的植物無法通過種子繁殖和長期保存，其種質(zhì)資源只能靠田間種植保存，耗費(fèi)人力物力， 且資源易受人為因素和環(huán)境因素影響。用組培方法，可大大節(jié)省人力、物力，延長保存期。-人工種子：植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生與

11、正常合子胚相似的胚狀體(embryoid)，將胚狀體包裹在含有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的包膜中，并在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗，稱為植物人工種子(plant artificial seeds)1977 年，Murashige 第一次提出人工種子構(gòu)想。把胚狀體包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具有種子的機(jī)能并可直接播種于田間次生代謝產(chǎn)物具有某種合成特殊物質(zhì)能力的植物細(xì)胞，通過組織培養(yǎng)獲得生物制品。-已在 400 多種藥用植物中建立了組織和細(xì)胞培養(yǎng)物，從中分離出 600 多種代謝產(chǎn)物，包括利用細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的有用物質(zhì)制成的藥品、營養(yǎng)品、飲料、香煙、化妝品等商品已投放市場紅豆杉：紫杉醇，抗癌首選藥物，每升細(xì)胞培

12、養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá) 0.25mg。鴨腳樹種子：利血平，降血壓，愈傷組織。人參根：人參皂苷，保健品利用組培技術(shù)獲得次生代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)：次生代謝產(chǎn)物是在完全人工控制的條件下生產(chǎn)的，不受地區(qū)和季節(jié)限制，節(jié)約土地，便于工業(yè)化生產(chǎn)。通過選擇優(yōu)良品系和改變培養(yǎng)條件，可得到超越原植物產(chǎn)量的代謝物-高效率。-對新疆紫草進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得了比原植株含量高 6 倍的紫草素。對有效成分的合成路線進(jìn)行遺傳操作，大規(guī)模生產(chǎn)我們所需的有效次生代謝產(chǎn)物。-對毛花洋地黃品系進(jìn)行組織培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中加入生物合成途徑的中間化合物毛地黃毒素和一甲基毛地黃毒素，能使毛地黃毒苷或其 6甲基衍生物在 C12 位置羥基化而轉(zhuǎn)化成更有醫(yī)

13、藥價(jià)值的強(qiáng)心劑地高辛或 6甲基地高辛，轉(zhuǎn)化速率幾乎 100 。植物組織培養(yǎng)脫毒的原理和意義植物組織培養(yǎng)脫毒的原理：莖尖分生組織不帶毒或帶毒少。-感病植株體內(nèi)的病毒分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位和年齡而異，越靠近莖尖頂端的區(qū)域，病毒的濃度也越低。-分生區(qū)域無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，其傳遞速度低于細(xì)胞分裂和生長的速度。 無病毒苗培育的意義用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無毒苗，是一個(gè)積極有效的途徑，排除了使用藥劑，減少污染、防止公害、保護(hù)環(huán)境。無病毒苗可以表現(xiàn)出明顯的優(yōu)良效果。-草莓可增產(chǎn) 20%50%，植株結(jié)果多，單果重增加，上等果比例提高。-菊花切花品種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，

14、切花較重等特點(diǎn)。-日本用柑桔莖尖微嫁接繁殖無病毒柑桔營養(yǎng)系；美國用組織培養(yǎng)法，使蘋果無病毒苗已工廠化育苗。植物組織培養(yǎng)中需要的環(huán)境條件如溫度、光照、濕度等（我猜這個(gè)考填空）在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH 值、滲透壓等各種化學(xué)條件都會(huì)影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。溫度(temperature)溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以 28最好，在 20以下，33以上形成率皆最低。大多數(shù)植物組織培養(yǎng)在 2327之間進(jìn)行，一般采用 252。低于 15植物組織生長停止，高于 35 對植物生長不利。-不同植物培養(yǎng)的

15、適溫不同，百合的最適溫度是 20、月季足 25-27、番茄是 28。-桃胚在 2-5條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用 35處理草莓的莖尖分生組織 3-5d，可得到無病毒苗。光照(light)主要涉及光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面光照強(qiáng)度(light intensity)光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，特別對外植體細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。 光照強(qiáng)度強(qiáng)，幼苗生長粗壯；而光照強(qiáng)度較弱，幼苗容易徒長。光質(zhì)(light wave)光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)、培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。-百合珠芽在紅光下培養(yǎng) 2 周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)幾周后，

16、才出現(xiàn)愈傷組織，-唐菖蒲子球塊接種 15d 后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)光周期(light period)試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期，最常用的周期是 16h 的光照，8h 的黑暗。-對短日照敏感品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，如紅花、烏飯樹。 濕度 (humidity)-容器內(nèi)濕度主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，培養(yǎng)基干硬不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，會(huì)導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。-環(huán)境的相對濕度濕度過低會(huì)使培

17、養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長霉，造成污染一般要求相對濕度 70%80%，常用加濕器或?yàn)⑺姆椒▉碚{(diào)節(jié)。滲透壓(penetrating pressure)培養(yǎng)基中含有鹽類、蔗糖等化合物，其濃度、含量變化能影響滲透壓的變化。1-2 個(gè)大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2 個(gè)大氣壓以上對植物生長有阻礙作用，5-6 個(gè)大氣壓使植物生長完全停止，6 個(gè)大氣壓以上植物細(xì)胞不能生存。pH 值 (pH value)不同植物對培養(yǎng)基最適 pH 值的要求不同，大多 5-6.5，一般 5.8。培養(yǎng)基的組成影響 pH 值。以硝態(tài)氮作氮源以銨態(tài)

18、氮作氮源當(dāng) pH 值高于 6.5 時(shí)，培養(yǎng)基變硬；低于 5 時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。高溫滅菌會(huì)降低 pH 值(約 0.2-0.3 個(gè) pH 值) 。可用 0.1M 的 NaOH 和 0.1M 的 HCI 調(diào)整 pH 值。氧氣(oxygen)氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題。棉塞封閉瓶口通氣最好，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染;可用附有濾氣膜的封口材料 固體培養(yǎng)基中加入活性炭可增加通氣度，利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等生長素與細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)過程中的作用和相互關(guān)系生長素類(au

19、xin)生長素主要用于愈傷組織誘導(dǎo)、根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。-根對生長素最敏感，在極低的濃度下，(10-5-10-8ngL) 可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。-天然的生長素穩(wěn)定性差，易被高溫高壓或光照破壞，在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長素類物質(zhì)。IAA(indo acetic acid 吲哚乙酸) 天然存在，亦可人工合成，是生長素中活力最弱的，對器官形成的副作用小，易受高溫、高壓、光破壞，易被細(xì)胞中的 IAA 分解酶降解。NAA(naphthalene acetic acid 萘乙酸)啟動(dòng)組織培養(yǎng)的能力比 IAA 高出 3-4 倍，可人工合成，耐高溫高壓， 不

20、易被分解破壞，應(yīng)用較普遍。廣泛用于生根，與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。IBA(indolebutyri acid 吲哚丁酸) 促進(jìn)發(fā)根的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)啟動(dòng)能力比 IAA 高 10 倍，特別促進(jìn)愈傷組織的形成，但強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。細(xì)胞分裂素類 ( cytokinin )腺嘌吟的衍生物，包括 6-BA(6-芐基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激動(dòng)素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中 Zt 活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是 6-BA。-在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)

21、生長。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。激素配比模式生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向高：有利于根的形成和愈傷組織的形成適中：有利于根芽的分化低：有利于芽的形成生長素/細(xì)胞分裂素-使用濃度因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度為 0.05-5mgL，細(xì)胞分裂素 0.05-10mgL。4) GA ( gibberellic acid 赤霉素)20 多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是 GA3。-赤霉素和生長素協(xié)同作用，影響形成層的分化。生長素赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化；-赤霉素可用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖

22、、鱗莖等提前萌發(fā)；促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育；在器官形成后添加赤霉素，可促進(jìn)器官或胚狀體的生長。比較固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)固體與液體比較：優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，便于經(jīng)常觀察研究等。缺點(diǎn)：培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用；同時(shí)培養(yǎng)排除的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。固體培養(yǎng)法：用瓊脂固化培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的最常用方法。該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。液體培養(yǎng)法：用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧

23、氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r/min。技能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。解釋高壓滅菌時(shí)排除鍋內(nèi)空氣的原因和過程增壓前，完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。-常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到 O.05MPa 時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到壓力 0.1-0.15MPa，20min。滅菌的過程培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個(gè)步驟：首先，往高壓滅菌鍋內(nèi)（外層鍋內(nèi)加水），加水水位高度不超過支柱高度。其次，將分裝好的培養(yǎng)基及所需滅菌的各種用具、蒸餾水等，放入高壓滅菌鍋的消毒桶內(nèi)

24、，蓋好鍋蓋，對稱擰緊螺絲。第三，加熱高壓滅菌鍋，打開放氣閥，待煮沸排出冷空氣后再關(guān)閉。第四，鍋上壓力表指針開始移動(dòng)，當(dāng)指針移至 1.11.2 kg/cm2，溫度為 121時(shí)，維持該壓力 20min 即可切斷電源，待壓力降為 0 后，才能打開鍋蓋。選擇外植體應(yīng)考慮哪些因素？1、 植物種質(zhì)的選擇：易于離體培養(yǎng)的品系；生產(chǎn)、研究上有重大意義的品系；考慮褐化問題。2、 外植體的大小：外植體的表面積、體積、細(xì)胞數(shù)量會(huì)影響培養(yǎng)效果。一般選擇 1-2cm 左右大小。太大容易污染，太小不易啟動(dòng)或啟動(dòng)后僅產(chǎn)生愈傷組織。特殊組織器官按器官或組織單位切離 。3、外植體的年齡和著生部位：外植體的幼化程度直接影響組織培

25、養(yǎng)的結(jié)果。 來源于幼年植物的外植體比源于成年植株的外植體更易培養(yǎng)。較低部位外植體要比上部的外植體容易啟動(dòng)。4、取外植體的季節(jié)和時(shí)間：處于生長季節(jié)的外植體 更易培養(yǎng)。春季取材含菌數(shù)少，秋冬季取材難以成功。雨季、濕熱季節(jié)取材難以成功。種質(zhì)優(yōu)良，植株健壯，取材的最適時(shí)期，適宜的大小外植體消毒的過程第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，沖洗干凈，把材料切割成適當(dāng)大小。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸；另外一種理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)Tween80第二步，在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)，對材料的表面浸潤滅菌。用 70%酒精浸

26、1030s。70%酒精具有浸潤植物組織材料的作用，70%酒精具有較強(qiáng)的殺菌力 70%酒精穿透力強(qiáng)，易殺傷植物細(xì)胞，浸潤時(shí)間不能過長。第三步，用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取。用滅菌劑處理后，需要用無菌水沖洗數(shù)次。 具體過程：把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，使消毒徹底。在結(jié)束前 1-2min，把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。在滅菌溶液中加吐溫-80 或 Triton X 效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更

27、易于展布，更容易浸人到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的 O.5%。最后用無菌水涮洗，每次 3min 左右，視采用的消毒液種類，涮洗 3-l0 次左右，以免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。分析組織培養(yǎng)過程中影響褐變的因素植物品種：不同品種的褐變程度是不同的，主要在于多酚氧化酶活性上的差異，因此在培養(yǎng)過程中，應(yīng)該對不同的品種分別進(jìn)行處理。生理狀態(tài)：由于外植體的生理狀態(tài)不同，接種后褐變程度也有所不同。處于幼齡期的植物材料或幼嫩的組織褐變程度不明顯，而從成年的植株或老熟的組織采收的外植體，含醌類物質(zhì)較多，容易褐變。培養(yǎng)基成分：無機(jī)鹽濃度過高，

28、會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加；細(xì)胞分裂素的水平過高會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。培養(yǎng)條件不當(dāng)：光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。分析組織培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因在試管苗玻璃化過程中，作為內(nèi)源激素的乙烯從代謝調(diào)節(jié)上起了關(guān)鍵性啟動(dòng)作用，乙烯的產(chǎn)生則取決于培養(yǎng)環(huán)境中的脅迫條件，如水勢不當(dāng)，通氣不暢（造成缺氧）及培養(yǎng)基用 BA 量過高等；乙烯產(chǎn)生后引發(fā)了其他激素質(zhì)和量上的改變及酶類的變化；因此發(fā)生蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃化癥狀瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負(fù)相關(guān)，瓊脂或蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。培養(yǎng)基中 BA 濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)，BA 濃度越高或培養(yǎng)溫度越高，玻璃苗比率越大。培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體與外界交換不暢。培養(yǎng)基中無機(jī)離子種類及比例不當(dāng)：