過表達Gnb2l1基因?qū)w外節(jié)律基因mPer1表達的影響

1、過表達Gnb2l1基因?qū)w外節(jié)律基因mPer1表達的影響過表達gnb2l1基因?qū)w外節(jié)律基因per1表達的影響【關(guān)鍵詞】時間生物學(xué);節(jié)律基因;gnb2l1基因;per1基因;轉(zhuǎn)染【關(guān)鍵詞】時間生物學(xué);節(jié)律基因;gnb2l1基因;per1基因;轉(zhuǎn)染生物體普遍存在調(diào)控生命活動約為24h的近日節(jié)律1。per1為近日節(jié)律振蕩器的核心組件，per1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的磷酸化和入核在近日節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)控中起重要作用。perid1(per1)是近日節(jié)律系統(tǒng)中的核心蛋白,并且與機體其他功能諸如藥物依賴、腫瘤發(fā)生等2-3親密相關(guān)。gnb2l1是一個看家基因，在細胞承受刺激的時候，gnb2l1基因可以迅速作出反響，編碼合成

2、rak1蛋白，實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后程度調(diào)控，并進一步引發(fā)一系列遲發(fā)反響。前期研究說明rak1蛋白為per1互相作用的節(jié)律相關(guān)蛋白，上調(diào)及下調(diào)per1基因并未影響rak1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達4。因此推測rak1并非per1的下游鐘控蛋白，rak1可能通過參與/介導(dǎo)per1相關(guān)的信號分子通路，進而影響per1節(jié)律及其他功能的實現(xiàn)。因此本文研究過表達gnb2l1發(fā)現(xiàn)per1表達量明顯增高，可以推測gnb2l1可能是per1的上游鐘控基因。進一步提醒生物節(jié)律信號通路的分子機制、研究rak1與per1的功能聯(lián)絡(luò)提供了基矗1材料與方法1.1細胞株nih3t3細胞由華西醫(yī)學(xué)中心微生物教研室饋贈。1.

3、3細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)細胞于含10%小牛血清、100ul-1青霉素及100ul-1鏈霉素的de培養(yǎng)基中，5%2孵箱內(nèi)37靜置培養(yǎng)。nih3t3細胞按每孔2105個細胞接種于十二孔板，待細胞12h貼壁后，更換新穎培養(yǎng)基(每孔1.98l)，每孔加pa20l，終濃度為100nl-1。1.4轉(zhuǎn)染pa刺激24h后，按照脂質(zhì)體lipfetainetx2000說明書，將pdna3.1/gnb2l1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染nih3t3細胞(a組)，以pdna3.1/vetr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞為對照(b組)。轉(zhuǎn)染12h后，每隔2h分別搜集實驗組和對照組細胞各3孔，共搜集48h，24個時間點。1.6統(tǒng)計分析實驗結(jié)果以(xs)表示。采用t檢驗

4、進展比擬，以p0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1過表達效率的鑒定過表達gnb2l1基因轉(zhuǎn)染后可導(dǎo)致節(jié)律基因per1表達顯著性增高(見圖3，圖4)。圖中可以看出zt8，zt11和zt12的作用更顯著，其余的時間點普遍a組比b組高。圖3per1電泳圖圖4per1rnas表達2.3余弦法分析per1的表達周期用余弦法分析，典型的結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示實驗組(a組)的per1表達中值比對照組(b組)明顯增高，但per1表達的振幅和相位，a組與b組的并無明顯差異(p0.05)。圖5余法分析per1rnas節(jié)律表達3討論gnb2l1是一個看家基因，在正常細胞中它編碼合成rak1蛋白。rak1蛋白作為

5、胞內(nèi)重要的骨架蛋白、接頭蛋白、錨定蛋白5-11，參與細胞內(nèi)信號分子復(fù)合物生成、影響活性分子亞細胞定位、溝通不同信號通路之間的聯(lián)絡(luò)，從而發(fā)揮其對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達、細胞增殖分化等各方面的調(diào)節(jié)作用，因此研究者普遍認為rak1參與了生物體許多重要的生理過程。在神經(jīng)科學(xué)研究中，rak1蛋白是一個非常重要而活潑的研究領(lǐng)域，神經(jīng)系統(tǒng)的rak1功能具有相當?shù)膹?fù)雜性12-15。per1在近日節(jié)律鐘控系統(tǒng)中處于核心地位。目前研究發(fā)現(xiàn)per1主要通過pas構(gòu)造域介導(dǎo)蛋白間互相作用而發(fā)揮生理功能，但其確切機制尚不清楚。rak1作為胞內(nèi)接頭蛋白，介導(dǎo)了pk、pka等信號通路及其之間的聯(lián)絡(luò)，上述信號通路已證實在近日節(jié)

6、律輸入輸出通路中發(fā)揮著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，rak1與per1蛋白的細胞內(nèi)分布改變有關(guān)，提示rak1可能介導(dǎo)了per1的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位、入核。rak1與per1的結(jié)合也可能并非意味著rak1直接介導(dǎo)per1功能，而提示rak1以橋接分子的形式和per1結(jié)合，并通過將per1與其他活性分子(諸如受體，蛋白激酶，細胞因子，轉(zhuǎn)錄因子等)相聯(lián)絡(luò)而參與per1相關(guān)功能實現(xiàn)(諸如per1從胞漿轉(zhuǎn)位到核周以及per1分子對于近日節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控等)。本研究進一步完善近日節(jié)律的分子機制，而且對生物節(jié)律相關(guān)疾病的發(fā)病機制乃至治療的研究提供新的思路和方向。但是gnb2l1與per1的互相作用非常復(fù)雜，如要明確

7、之間的作用機制還需進一步深化研究?！緟⒖嘉墨I】1harersl,pandas,kaysa.leularbasesfiradianrhythsj.annurevelldevbil,2001,17(11):215-253.2abara,albrehtu,spanagelr.ainesensitizatinandreardareundertheinfluenefiradiangenesandrhythj.prnatlaadsiusa,2002,99(13):9026-9030.3ful,lee.theiradianlk:paeakerandtuursuppressrj.natrevaner,2022

8、,3(5):350-361.4魯芳,胡麗娟,汪宇輝,等.hperid1_(pas)構(gòu)造域互相作用蛋白的挑選和研究j.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2022,19(4):246-247.7aidipudiv,zhangj,leek,etal.rak1regulatesg1/sprgressinbysuppressingsrkinaseativityj.lellbil,2022,24(15):6788-6798.8bessna,ilsntl,yngv,etal.theanhringprteinrak1linksprteinkinaseepsilntintegrinbetahainsrequireentsfradhesinandtilityj.jbilhe,2002，277(24):22073-22084.12elherj,eeberej,vargaa,etal.prteinkinasesignaltransdutinasadesinaalianassiativenditiningj.neursientist,2002,8(2):122-131.14battainif,pasalea,palettir,etal.therlefanhringprteinrak1inpkativatininth