瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理及步驟

1、實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA 片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相

2、對(duì)可以提供一個(gè)用于確定DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254365nm波長紫外光照射下，呈桔紅色熒光，因此也可對(duì)分離的DNA進(jìn)行檢測(cè)。一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.2kb50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)介紹瓊脂糖凝膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在DNA片段分離中的應(yīng)用方法。 二、儀器及試劑1.儀器及耗材：水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點(diǎn)樣板或parafilm、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。2.試劑及配制：50TAE緩沖液的配制：2

3、 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。1TAE緩沖液的配制：稱量20 ml的50TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。6上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%

4、甘油。配制：10 ml 溴酚藍(lán) 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml用6TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20保存。其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder 、瓊脂糖、三、操作步驟1. 制備1瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱取0.7 g（0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70 ml（50ml）1TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。2. 膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位

5、置放好梳子。將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。3. 加樣：在點(diǎn)樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。4. 電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60100V，樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）

6、方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1TAE溶液染色約20 min，再用清水漂洗10 min。(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。四、常見問題及注意事項(xiàng)1配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。2瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時(shí)要輕緩。3電泳時(shí)應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。4溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時(shí)應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。5紫外線對(duì)人體有損傷作用，開燈時(shí)間不宜太長，注意防護(hù)。6DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。7質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此