幾丁質酶抑制化合物產(chǎn)生菌的篩選初探

1、幾丁質酶按捺化合物產(chǎn)生菌的挑選初探謝潔周澤揚張新軍藍希鉗胡軍華【關鍵詞】幾丁質酶；,按捺化合物；,產(chǎn)生菌摘要：從采自天下的200多份土樣中分散出1350多株菌，使用平板透明圈法和鐵氰化鉀要領，以家蠶中腸幾丁質酶作為靶標，從這些菌株中挑選出家蠶幾丁質酶按捺化合物的產(chǎn)生菌1237#，經(jīng)開端斷定該菌株為假單胞菌。本文重要先容幾丁質酶按捺化合物挑選體系的創(chuàng)立、活性物質性子的開端探究及目的菌株的斷定。關鍵詞：幾丁質酶；按捺化合物；產(chǎn)生菌PreliinarysreeningfhitinaseinhibitrprduingstrainsABSTRATIntheursefsreeningfrnehitinas

2、einhibitr,usingthesilkrhitinaseasatarget,andtransparentinhibitinzneplateassayandptassiuferriyanideethd,astrainbelngingtthePseudnas,naed#1237asislatedang1350strainsfr200silsaples.Thesreeningpredureandthepreliinarystudyftheultureerealsreprted.KEYRDShitinase;Inhibitr;Prduingstrain幾丁質是甲殼類動物、昆蟲外骨骼和真菌細胞壁的

3、緊張構成身分，它是N乙酰葡萄糖胺以1，4鍵毗連起來的直鏈多聚物。幾丁質在天然界中的存在量僅次于纖維素位居第二。幾丁質酶是一類能把幾丁質落解為N乙酰胺基葡萄糖或寡聚N乙酰胺基葡萄糖的水解酶。真菌必要幾丁質酶落解子母細胞之間的隔以完成其生殖歷程；昆蟲發(fā)育歷程中也必要幾丁質酶部門落解外骨骼以完成其失常發(fā)育的歷程，因此在真菌生殖階段和昆蟲蛻皮階段其體內幾丁質酶的活性明顯增高。由于幾丁質酶在真菌出芽生殖和昆蟲蛻皮歷程中發(fā)揮了極為緊張的作用，這就使得幾丁質酶大概成為生物殺蟲劑和抗真菌藥物埋頭性作用的靶目的。同時由于哺乳動物不以幾丁質代謝作為生命運動必須體系1，故以幾丁質酶作為靶目的的生物殺蟲劑和抗真菌藥物

4、具有對人畜無害的長處。至今已報道的幾丁質酶按捺劑重要有：Allsaidin2、Argifin3、Argadin3、Deetyallsaidin4等。恒久以來日本等國不停在舉行幾丁質酶按捺化合物的研究，但海內至今未見與幾丁質酶按捺化合物相干的研究陳訴。本研究旨在從我國富厚的微生物資源中得到具有自主知識產(chǎn)權的新型幾丁質酶按捺化合物及其消費菌株，為開拓具有新型作用點的殺蟲抗真菌藥物奠基基矗1質料與要領1.1造就基1.2幾丁質酶粗酶提取家蠶初蛹中腸液，經(jīng)硫酸銨鹽析、透析后凍干保存?zhèn)溆?；幾丁質由日本信州大學下板誠傳授贈予；膠體幾丁質：使用鹽酸處置懲罰幾丁質制備5。1.3活性菌株的液體造就要領菌體接種于液

5、體造就基，37振蕩造就6d，造就液8000r/in離心10in，取上清檢測活性。1.4幾丁質酶按捺物的檢測要領1.51237#菌株產(chǎn)生的幾丁質酶按捺化合物理化性子開端探究1.6幾丁質酶按捺物產(chǎn)生菌的菌種斷定7參照?伯杰氏細菌斷定手冊(第八版)?舉行菌種斷定。2效果2.1使用平板透明圈法開端挑選出幾丁質酶按捺物產(chǎn)生菌由于平板透明圈法挑選幾丁質酶按捺物快捷、直不雅，以是在粗篩的歷程中接納此法。本研究從泥土中分散出的1000多株菌中挑選出菌株1237#，其代謝產(chǎn)物對家蠶幾丁質酶具有很強的按捺活性(圖略)。2.2化學要領進一步驗證1237#對家蠶幾丁質酶的按捺作用在使用平板透明圈法開端確定了假單胞菌1

6、237#代謝產(chǎn)物對家蠶幾丁質酶活性的按捺作用的底子上，我們使用化學要領進一步確定了該菌次級代謝產(chǎn)物對家蠶幾丁質酶的按捺活性。舉行三次重復，其Abs如圖1所示。從幾丁質酶活力的盤算公式中，我們可以看出，在別的條件都穩(wěn)定的環(huán)境下，酶活性的強弱取決于Abs的大校闡發(fā)幾組數(shù)據(jù)，得出在參加1237#菌株的造就液后，家蠶幾丁質酶的活性被按捺了513%。化學要領進一步確定了該菌株次級代謝產(chǎn)物中含有對幾丁質酶活性具有按捺作用的物質。1：正常環(huán)境下的Abs；2：參加具幾丁質酶按捺活性的發(fā)酵液后的Abs圖1假單胞菌123#次級代謝產(chǎn)物對家蠶幾丁質酶的按捺作用2.3幾丁質酶按捺化合物理化性子的開端探究2.4幾丁質酶

7、按捺物產(chǎn)生菌的分散、純化、斷定從天下網(wǎng)羅的300多份土樣中分散出1000多株菌，這些菌重要是細菌和真菌。從這批菌種中我們挑選到幾丁質酶按捺物的產(chǎn)生菌1237#，按照其菌落形態(tài)和菌體形態(tài)，參照伯杰氏細菌斷定守那么斷定該菌株為假單胞菌，部門性子見表1。表11237#菌株部門性子檢測工程效果檢測工程效果革蘭染色陰性直徑/長0.5/2氧化酶反響陽性明膠水解反響陽性打仗酶反響陽性生長溫度影響最適溫度：37；4不生長，41能生長3小結本研究在創(chuàng)立輕便、快速幾丁質酶按捺化合物的檢測要領(平板透明圈法)的底子上，從泥土中挑選到假單孢菌1237#。該菌株的次級代謝產(chǎn)物中含有幾丁質酶按捺化合物。在對該幾丁質酶按捺

8、化合物性子開端探究的歷程中創(chuàng)造該物質不克不及耐受較高溫度，60處置懲罰30in喪失幾丁質酶按捺活性；活性物質是極性很強的水溶性化合物，乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯均不克不及將其萃取出來，同時氯仿對幾丁質酶按捺化合物的活性具有極大的粉碎作用，用氯仿萃取活性將完全喪失。從以上的研究效果可以開端推斷假單胞菌1237#次級代謝產(chǎn)物中的幾丁質酶按捺化合物大概是卵白質大概肽類物質。別的，該幾丁質酶按捺活性物質不會對淀粉酶的活性產(chǎn)生任何影響。關于該物質的純化和其相干基因的克隆事情尚在舉行中。參考文獻1BtRG,RenkeaGH,Verhek,etal.Thehuanhittrisidasegene:natur

9、efinheritedenzyedefiienyJ.JBilhe,1998,273:256803HustnDR,ShiiK,AraiN,etal.Highreslutinstruturesfahitinaseplexedithnaturalprdutylpentapeptideinhibitrs:iiryfarbhydratesubstrateJ.PrNatlAadSiUSA,2002,99(14):91274SakudaS,NishitY,hi,etal.Effetsfdeethylallsaidin,aptentyeasthitinaseinhibitr,ntheelldivisinfyeastJ.AgrBilhe,1990,54(5):13335NitdaT,KuruataniH,KanzakiH,etal.Iprvedbiassayethdfrspdpteraliturahitinasein