阿米卡星對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷作用

1、阿米卡星對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷作用劉雙月,王愛梅,許濤,牟華【摘要】目的研究阿米卡星(aikain，ak)在不同給藥時間內(nèi)對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷作用，討論ak的耳毒性。方法豚鼠隨機分為對照組、ak3d組、ak7d組和ak11d組。采用異硫氰酸四甲基羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽熒光染色方法，并結(jié)合聽腦干反響(auditrybrainsterespnse，abr)測試，觀察用藥前后耳蝸毛細胞形態(tài)及聽功能的改變。結(jié)果ak首先損傷耳蝸底回的外毛細胞,并且隨著給藥時間延長，損傷逐漸向頂回開展，外毛細胞缺失明顯增多，而ak對內(nèi)毛細胞的損傷要輕于外毛細胞。聽功能改變與形態(tài)學變化根本一致。結(jié)論ak可損傷豚鼠耳蝸毛細胞

2、，導致聽功能下降。【關(guān)鍵詞】阿米卡星;豚鼠;耳蝸;聽腦干反響ipairenteffetfaikainnhlearhairellsinguineapigliushuangyue,angaiei,xuta,uhua(departentfphysilgy,lianingedialuniversity,jinzhu121001hina)abstrat:bjetivetinvestigatetheipairenteffetfaikain(ak)nhlearhairellsinguineapigatdifferentinjetintie,andtexplrettxiityfak.ethdsguineapi

3、gsererandlyassignedtfurgrups:ntrlgrup,ak3-daygrup,7-daygrupand11-daygrup.tetraethylrhdaineisthiyanate-labeledphallidinestainingandauditrybrainsterespnse(abr)easureentereusedtevaluatethehangesfhairellsrphlgyandauditryfuntinbefreandafterthedrugtreatent.resultsuterhairells(hs)inthebasalturnserefirstipa

4、iredbyak,andtheipairentfhsdevelpedttheapialturnsithtieprlnging,andthelssfhsasinreasedsignifiantly.theinjuryfinnerhairells(ihs)induedbyakaslighterthanhs.hangefauditryfuntinasbasiallynsistentiththatfrphlgy.nlusinsakandaagethehlearhairells,leadingtdelineinauditryfuntin.keyrds:aikain;guineapig;hlea;audi

5、trybrainsterespnse氨基糖苷類抗生素(ainglysideantibitis，aan)具有強大的抗革蘭氏陰性桿菌的作用,加之價格低廉,是臨床控制感染的常用抗生素1。但是aan具有嚴重的耳毒性，可導致耳蝸毛細胞、前庭毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損傷2-3。阿米卡星(aikain,ak)為半合成的aan，亦可對耳蝸毛細胞造成不可逆性的損傷4，然而ak在不同給藥時間內(nèi)對豚鼠耳蝸毛細胞的損傷特點及其與聽功能變化的關(guān)系，目前尚不清楚。據(jù)此，本研究應(yīng)用異硫氰酸四甲基羅丹明(tetraethylrhdaineisthiyanate，trit)標記的鬼筆環(huán)肽熒光染色方法，并結(jié)合聽腦干反響(audi

6、trybrainsterespnse，abr)測試，觀察用藥前后豚鼠耳蝸毛細胞形態(tài)及聽功能的改變，以討論ak的耳毒性。1材料與方法1.1實驗動物安康白毛紅目豚鼠47只，體重250300g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，無中耳炎，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗期間所有豚鼠均在安靜狀態(tài)下飼養(yǎng)并給予常規(guī)飲食。1.2主要試劑和儀器阿米卡星注射液(0.1g/l，批號090327)由蘇州第六制藥廠消費，trit-鬼筆環(huán)肽購自美國siga公司，sartepae聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)由美國智聽公司消費，zeissa1熒光顯微鏡由德國zeiss公司消費。1.3動物分組與耳毒模型建立將動物隨機分成4組，即對

7、照組10只，ak3d組11只，ak7d組12只，ak11d組13只。以上4組中，ak3d組、7d組和11d組每天肌肉注射ak400g/kg，分別連續(xù)給藥3d、7d和11d;對照組那么每日肌肉注射等量生理鹽水。用藥期間監(jiān)測動物體重以調(diào)整藥量。1.4abr測試各組動物于用藥前及停藥后24小時內(nèi)分別測試abr。操作在隔音屏蔽室內(nèi)進展。豚鼠用1%戊巴比妥鈉40g/kg經(jīng)腹腔麻醉后，將電極的正極置于動物顱頂正中皮下，負極置于給聲側(cè)耳廓后下，接地電極置于對側(cè)耳廓后下，屏蔽耳機距測試豚鼠外耳道口0.5。應(yīng)用sartepae聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音(tneburst)刺激,選取4、12、24k

8、hz3個頻率分別進展測試并記錄abr閾值(聽閾)。重復(fù)率39.10次/s，帶通濾波1001500hz，疊加1024次，掃描時程16.0s。聲刺激強度從95dbspl開場，以5db逐次遞減，聽閾斷定以剛出現(xiàn)abr波為準并至少重復(fù)兩次。同一刺激頻率下給藥前后的聽閾差值記為abr閾移。1.5耳蝸鋪片trit-鬼筆環(huán)肽熒光染色各組豚鼠于最后一次abr測試完畢后，快速斷頭，取出聽泡。解剖顯微鏡下去除鐙骨，翻開前庭窗和蝸窗，用含有4%多聚甲醛的0.1pbs(ph7.4)灌流3次，并置于該溶液中4下固定24h。然后將標本置于8%edta中脫鈣23d。pbs漂洗2次后，于解剖顯微鏡下別離全耳蝸基底膜。將基底膜

9、置于0.25%tritnx-100溶液中浸泡50in，然后進展trit-鬼筆環(huán)肽染色45in。pbs漂洗后分回鋪片，以熒光封固劑封片。熒光顯微鏡下觀察各回毛細胞損傷情況。1.6統(tǒng)計學分析應(yīng)用spss16.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進展統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以s表示。各組之間abr閾移的比擬采用單因素方差分析，p0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1trit-鬼筆環(huán)肽熒光染色熒光顯微鏡下觀察，可見trit標記的鬼筆環(huán)肽染色呈現(xiàn)紅色熒光，主要定位在外毛細胞(uterhairell,h)和內(nèi)毛細胞(innerhairell,ih)的靜纖毛、表皮板。此外，deiter細胞等亦有絲狀f-肌動蛋白(f-atin)

10、的表達。對照組耳蝸毛細胞形態(tài)構(gòu)造完好，三排h的纖毛呈v形排列整齊，一排ih的纖毛呈一形排列，耳蝸各回h和ih均無缺失(圖1a)。ak3d組耳蝸底回h偶有缺失，而其它回h以及各回ih均無損傷(圖1b)。ak7d組耳蝸底回h的缺失有所增多，并向上開展到第二回;ih根本正常(圖1)。ak11d組耳蝸底回h出現(xiàn)大量缺失并向上延伸到頂回，缺失區(qū)域被deiter細胞取代形成網(wǎng)狀瘢痕;ih出現(xiàn)散在損傷(圖1d)。2.2abr測試連續(xù)給藥后，在各刺激頻率下，ak3d組豚鼠的abr閾移與對照組比擬均無顯著性差異(p0.05);ak7d和11d組豚鼠的abr閾移與對照組比擬均有顯著性差異(p0.01)，并且隨著a

11、k給藥時間的延長，abr閾移亦明顯增大(p0.01)(圖2)。注：與對照組比擬p0.01，*與ak3d組比擬p0.01，與ak7d組比擬p0.013討論f-atin是一種耳蝸毛細胞骨架蛋白，具有收縮及固定靜纖毛、使h運動、保持毛細胞形狀以及支持和傳導等多種作用5。trit標記的鬼筆環(huán)肽是一種特殊的f-atin標記物，因此可以用于識別耳蝸毛細胞，判斷其形態(tài)變化。我們采用耳蝸基底膜鋪片，觀察到經(jīng)trit標記的鬼筆環(huán)肽染色呈現(xiàn)紅色熒光，主要定位在h和ih的靜纖毛、表皮板，并且在deiters等支持細胞也有f-atin的表達。這與以往學者的觀察結(jié)果相一致6。在體和離體實驗說明，aan引起的耳蝸毛細胞損

12、害總是從耳蝸底回開場并逐漸向頂回開展，并且h的損傷要先于ih7。本實驗觀察到，ak首先損傷耳蝸底回的h，并且隨著給藥時間延長，h損傷從底回向頂回延伸，h缺失數(shù)量逐漸增多，而ih的損傷要遠輕于h，符合aan耳毒性的損傷規(guī)律。丁大連等7125-131將bdipy標記的慶大霉素投放到耳蝸器官培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察到h攝取慶大霉素的才能強于ih，底回h攝取慶大霉素的才能強于頂回h。因此，豚鼠耳蝸頂回和底回對ak的敏感性不同，可能與耳蝸頂回和底回h對ak的攝取才能不同有關(guān)。巴云鵬等8報道，豚鼠連續(xù)注射ak3d之內(nèi)，聽力損傷不明顯，而連續(xù)用藥6d后，與用藥前相比abr閾值那么有顯著的變化。我們觀察到的結(jié)果與巴云鵬

13、等的研究結(jié)果根本一致。本實驗連續(xù)注射ak3d后，abr閾移較對照組無明顯變化(p0.05);而連續(xù)注射ak7d后，abr閾移明顯增大，并且在連續(xù)注射11d后，abr閾移到達最大，與形態(tài)學損傷相平行;并且隨著給藥時間的延長，ak的耳毒性效應(yīng)亦逐漸增強，呈現(xiàn)明顯的時效關(guān)系。此外，本實驗還觀察到，雖然ak3d組豚鼠abr閾移與對照組比擬無顯著性差異，但是耳蝸底回已開場有h缺失，說明ak引起耳蝸形態(tài)方面的損傷要早于聽功能的改變，同時也進一步證實了aan可在內(nèi)耳蓄積，而最后的聽力損傷是這種蓄積的結(jié)果7125-131。目前認為，aan可以與金屬鐵形成aan-鐵復(fù)合物，其具有氧化復(fù)原活性，可催化體內(nèi)自由基的

14、大量產(chǎn)生。過多的自由基將打破其在體內(nèi)的平衡，通過激活調(diào)節(jié)細胞死亡的信號轉(zhuǎn)導途徑及其相關(guān)基因，使構(gòu)成生物膜的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子發(fā)生過氧化，從而引起耳蝸毛細胞損傷及死亡，最終導致聽力喪失。為此，人們嘗試應(yīng)用依布硒啉、甲磺酸去鐵胺(deferxaineesylate，df)等抗氧化劑來防護ak的耳毒性并獲得了較好效果4213-217,8157-161，說明ak的耳毒性亦與其促進自由基的過量生成有關(guān)。至于ak的耳毒性損傷中，自由基通過激活哪些信號轉(zhuǎn)導途徑繼而引起耳蝸毛細胞的死亡，尚需進一步深化研究?！緟⒖嘉墨I】1龍敏,陳蓉，王穎.氨基糖苷類抗生素耳毒性的藥物防治方法研究進展j.中國藥房,2

15、022,16(16):1264-1265.2aelersa,ngea,brandy,etal.satstatinandgentaiin-induedauditryhairelllssj.laryngspe,2022,119(5):933-937.3leaine,rib,behar-henf,etal.therlefpkzetainaikain-induedapptsisinthehlea:preventinbyaspirinj.apptsis,2022,12(2):333-342.4趙晨,楊寧,李巍,等.依布硒啉對丁胺卡那霉素致豚鼠耳蝸毒性保護作用的實驗研究j.聽力學及言語疾病雜志,2022,3(16):213-217.5李虹,紀旭,姜學鈞.