白芍總苷和當(dāng)歸提取物對離體肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

1、白芍總苷和當(dāng)歸提取物對離體肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用陳象青謝軍方焱張善堂劉圣【摘要】目的觀察白芍總苷和當(dāng)歸提取物合用對離體肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法采用甲醛誘導(dǎo)小鼠離體肝細(xì)胞凋亡。結(jié)果白芍總苷和當(dāng)歸提取物合用可抑制小鼠肝細(xì)胞凋亡。結(jié)論白芍總苷和當(dāng)歸提取物合用對小鼠離體肝細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】白芍總苷當(dāng)歸提取物甲醛凋亡Abstrat:bjetiveTstudytheprtetiveeffetsfttalglusidesfPaenyandextratfrAngeliasinensisnhepatyteapptsis.ethdsHepatyteapptsisfieasinduedbyHh.R

2、esultsTGPandEASuldinhibithepatyteapptsisfieinvitr.nlusinTGPandEAshaveaprtetiveeffetnthehepatyteapptsis.Keyrds:Ttalglusidesfpaeny；ExtratfrAngeliasinensis；Hh；Apptsis乙型肝炎是由乙型肝炎病毒HepatitisBVirus,HBV引起的一種嚴(yán)重的世界范圍內(nèi)危害人類安康的疾病，HBV持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌等肝臟疾病，死亡率很高。T已把乙肝列為世界第九死因，尋找平安有效的抗HBV藥物已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界一項(xiàng)迫切任務(wù)。由于中藥治療

3、能有效地改善病癥體征，副作用少，醫(yī)療費(fèi)用較低，使用方便，因此是目前治療乙肝患者及無病癥病毒攜帶者的主要方法之一。有研究說明，病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞凋亡親密相關(guān)1，2，目前認(rèn)為,病毒感染后,產(chǎn)生肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面:TL可通過Fas/FasL及穿孔素/端粒酶B途徑引起肝細(xì)胞凋亡。爆發(fā)性肝衰竭早期,TL的這種作用,使肝細(xì)胞大量凋亡,繼而出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死,肝功能衰竭。亞急性和慢性重型肝炎時(shí),一些肝細(xì)胞增殖抑制因子分泌升高,如TGF、TNF-等對增殖的肝細(xì)胞也有很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用,肝細(xì)胞的大量凋亡可能是肝再生不良的重要原因之一。實(shí)驗(yàn)性爆發(fā)性肝衰竭中,乙肝病毒抗原特異性TL同乙肝病毒轉(zhuǎn)

4、基因小鼠肝細(xì)胞作用,可引起大量肝細(xì)胞迅速凋亡。因此，本人擬通過對小鼠離體肝細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的研究，尋找平安有效的抗HBV中藥。1材料與方法1.1藥品與試劑白芍總苷TGP由安徽醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)；當(dāng)歸提取物EAS由大東方藥業(yè)有限責(zé)任公司提取，批號：20220816，每克相當(dāng)于生藥5.9g，比重為1.30；云芝多糖由南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司饋贈(zèng)，批號：050124；甲醛由蚌埠生化試劑廠出品，批號：050407；ulterDNA-PrepReagentsKit試劑盒DNA-PrepLPR固定液、DNA-Prepstain染料為法國庫爾特公司產(chǎn)品。1.2儀器自動(dòng)平衡微型離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠；ulter-

5、XL/EPIS型流式細(xì)胞儀美國貝克曼公司。1.3動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，4周齡，安徽省醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物科提供，合格證：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號。1.4甲醛致小鼠離體肝細(xì)胞凋亡模型的制備選用4周齡的昆明系雄性小鼠，脫頸椎處死后，取221左右小塊肝左葉組織，加5lNS，在200目濾網(wǎng)上研磨，并不斷過濾，吹打成單細(xì)胞，4000r/in離心5in，棄去上清液，殘液振勻，取10l細(xì)胞液，加5l1%甲醛，24冷藏15in，4000r/in離心5in，棄去上清液，殘液分別加5lNS清洗，離心，去上清液，各管均洗2次，棄去上清液，殘液加50lDNA-PrepLPR固定液，振蕩，加450lDNA-Prepstain染料

6、，避光30in，用流式細(xì)胞儀檢測3，4，并與加5lNS組比擬。1.5TGP+EAS預(yù)防治療甲醛誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡用藥方案取4周齡的昆明系雄性安康小鼠24只，隨機(jī)分為4組：正常對照組，模型組，TGP+EAS組，云芝多糖組，每組6只。組每天ig相應(yīng)藥物，容積為0.2l/10g體質(zhì)量，組每天ig給予等容量NS，連續(xù)7d，第7天給藥前禁食自由飲水12h，給藥2h后，脫頸椎處死動(dòng)物。各取221左右小塊肝左葉組織，加5lNS，在200目濾網(wǎng)上研磨，并不斷過濾，吹打成單細(xì)胞，4000r/in離心5in，棄去上清液，殘液振勻，取10l細(xì)胞液，組加5lNS，組各加5l1%甲醛，24冷藏15in，4000r/in離

7、心5in，棄去上清液，殘液分別加5lNS清洗，離心，去上清液，各管均洗2次，棄去上清液，殘液加50lDNA-PrepLPR固定液，振蕩，加450lDNA-Prepstain染料，避光30in，用流式細(xì)胞儀檢測。2結(jié)果2.1對1%甲醛誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用由于甲醛是作用強(qiáng)烈的凋亡誘導(dǎo)劑，模型組肝細(xì)胞凋亡率到達(dá)77.1%，由于EAS+TGP和陽性藥物云芝多糖的保護(hù)作用，這兩組的肝細(xì)胞凋亡率分別為46.8%和48.4%。結(jié)果見表1及圖14。表11%甲醛對各組離體肝細(xì)胞周期和凋亡的影響略圖1正常組略圖2模型組略圖3藥物組略圖4陽性對照組略3討論本研究首先根據(jù)ulter公司提供的資料，將離體小鼠

8、肝細(xì)胞置于3%甲醛中，冷藏30in，誘導(dǎo)其凋亡，但發(fā)現(xiàn)作用過于強(qiáng)烈，凋亡或壞死幾乎到達(dá)100%，便加以改良，采用1%甲醛，冷藏15in，由表1及圖14可發(fā)現(xiàn)模型組肝細(xì)胞凋亡率為77%左右，而TGP+EAS組和陽性藥物云芝多糖組肝細(xì)胞凋亡率明顯下降46.8%，48.4%，同時(shí)G1期所占比例由模型組的17.6%上升到38.7%，36.1%，G2/期所占比例由模型組的5.3%上升到12.3%，11.9%，說明TGP和EAS合用對離體小鼠肝細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用。很多研究說明肝細(xì)胞凋亡是肝臟疾病病理變化過程中的普遍現(xiàn)象，研究肝細(xì)胞凋亡對于預(yù)防和治療肝臟疾病極為重要，細(xì)胞凋亡過程中具有其獨(dú)特和復(fù)雜的生

9、物化學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制，氧自由基、核酸內(nèi)切酶以及調(diào)控基因均參與細(xì)胞凋亡，尋求抗細(xì)胞凋亡的藥物已受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近年來，隨著天然藥物研究熱的興起，關(guān)于中醫(yī)藥治療肝炎的研究越來越多57，同時(shí)有研究說明：病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞凋亡親密相關(guān)，對肝細(xì)胞凋亡在病毒感染時(shí)肝臟病理生理變化過程中的地位,有人認(rèn)為,首先肝內(nèi)浸潤的TL識(shí)別被HBV感染的肝細(xì)胞,并誘導(dǎo)其凋亡;其次,由活化的TL產(chǎn)生干擾素等使巨噬細(xì)胞在部分組織聚集,并吞噬凋亡細(xì)胞;然后干擾素、活化巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子(如TNF-等)引起部分炎癥和微循環(huán)障礙,進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛壞死。這種假設(shè)合理解釋了肝細(xì)胞凋亡和肝臟炎癥反響之間的關(guān)

10、系及兩者在肝炎病理變化中的作用,并得到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的支持。凋亡失調(diào)在許多肝病的病理過程中起關(guān)鍵作用，凋亡增強(qiáng)可促進(jìn)肝細(xì)胞死亡而致肝病，藥物抑制凋亡可能減輕肝損害和促進(jìn)組織再生，因此，有關(guān)中藥或其有效成分對肝細(xì)胞凋亡影響的研究也逐漸增多8，9，如王福永等10發(fā)現(xiàn)丹參有抑制大鼠缺血-再灌注肝細(xì)胞凋亡作用，譚春雨等11發(fā)現(xiàn)扶正化淤方對DN肝纖維化大鼠肝細(xì)胞有保護(hù)作用，可促進(jìn)受損傷肝細(xì)胞的修復(fù),減少肝細(xì)胞凋亡。雖然這些研究還有待于進(jìn)一步深化，但它們?yōu)橹嗅t(yī)藥治療乙肝的研究提供了新的方法和思路。本實(shí)驗(yàn)擬通過白芍總苷和當(dāng)歸提取物合用對肝細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的初步研究，可為下一步中藥治療肝炎的開發(fā)研究提供借鑒?！緟⒖?/p>

11、文獻(xiàn)】1PatelT,GresGJ.ApptsisandhepatbiliarydiseaseJ.Hepatlgy,1995;21:1725.2LeastersJJ.TheithndrialpereabilitytransitinfrbiheialurisitytpathphysilgialehanisJ.Gastrenterlgy,1998,115,783.3姜泊,張亞歷,周殿文.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京:人民軍醫(yī)出版社,1996:177.4劉鼎新,呂證寶.細(xì)胞生物學(xué)研究方法與技術(shù).北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)結(jié)合出版社,1990:140.5周清榮，張園海，申悅平苦參素治療慢性乙型肝炎32例J.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2022，13350.6李季惠疏肝健脾方治療慢性乙型肝炎臨床觀察J.北京中醫(yī),2001，20(4):7.7樂恩施，邊壯清熱利濕法在慢性乙型肝炎中的治療作用J.天津中醫(yī)，2002，19124.8胡聰，胡彬.中藥復(fù)方及有效成分對肝細(xì)