免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書(shū)：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移

1、PAGE PAGE 266實(shí)驗(yàn)(九) 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移（Western Blotting）Western Blotting是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定在化學(xué)合成膜的支撐物上，然后以特定的親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡。免疫印跡的實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)步驟：固定（immobilization）：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。封閉（Blocked）：保持膜上沒(méi)有特殊抗體結(jié)合的場(chǎng)所，使場(chǎng)所處于飽和狀態(tài)，用以保護(hù)特異性抗體結(jié)合到膜上，并與蛋白質(zhì)反應(yīng)。初級(jí)抗體（第一抗體）是特異性的。第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶

2、，產(chǎn)生可見(jiàn)的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。一. 操作方法：SDSPAGE 將待檢測(cè)的抗原粗提取液、純化過(guò)程中的樣品或純化后的樣品以及標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白等用SDSPAGE分離。2轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維素薄膜上將轉(zhuǎn)移緩沖液冷至4。切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素薄膜，并用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，放置15min直到?jīng)]有氣泡。切割四張普通濾紙，其大小與膠尺寸大小相符，并將其浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕。在轉(zhuǎn)移槽中倒入200ml轉(zhuǎn)移緩沖液。電泳后，切取有用部分的膠，并很快地在轉(zhuǎn)移緩沖液中洗滌。打開(kāi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的膠板，依次放入：浸濕的海綿兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙用轉(zhuǎn)移緩沖液洗過(guò)的膠，并小心地趕走濾紙和膠

3、之間的所有氣泡。放上硝酸纖維素膜另兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙浸濕的海綿小心地合上轉(zhuǎn)移槽的膠板，并立即放入轉(zhuǎn)移槽中。倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，使其浸沒(méi)轉(zhuǎn)移膠板。插入電極，注意正負(fù)極方向（硝酸纖維素膜面向陽(yáng)極），打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)調(diào)至80mA，4h；或調(diào)至膠的面積（cm2）0.8mA，2h。 （10）轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開(kāi)膠板取出硝酸纖維素薄膜。 3. 免疫印跡膜的處理：用TBS緩沖液洗膜510min。將膜用封閉溶液封閉，用搖床輕搖（37）60min。用TBS緩沖液洗膜三次，每次10min。將膜置于第一抗體溶液（小牛血清免疫兔的抗血清，110）中，置搖床上輕搖，37搖動(dòng)2h或4過(guò)夜。去掉第一抗體溶液，并用TTBS洗膜3

4、次，每次10min。將膜置于辣根過(guò)氧化酶羊抗兔IgG溶液（1500）中，37輕搖2h。去掉辣根過(guò)氧化酶羊抗兔IgG溶液，并用TTBS洗膜三次，每次10min。最后用TBS溶液洗，以轉(zhuǎn)移Tween20。加底物溶液反應(yīng)210min，至抗原區(qū)帶顯色清楚為止。用去離子水洗滌，以終止反應(yīng)。將膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。 另外，加底物溶液的顯色反應(yīng)，亦可用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）代替，以增加其靈敏度，即將膜經(jīng)ECL kits處理后，用放射自顯影法在X光片上留下清晰的圖像。4. 試劑和器材試劑：小牛血清免疫兔的抗血清辣根過(guò)氧化酶羊抗兔IgG（1500稀釋?zhuān)㏕BS緩沖液：20mM Tris-HCl,500mM NaCl, pH:7.5TTBS緩沖液：TBS緩沖液加0.05% Tween-20封閉液：0.5% 雞卵清蛋白TBS底物溶液：臨用前配制0.1M檸檬酸6.1ml；0.2M Na2HPO4.12H2O 6.4ml；蒸餾水12.5ml；鄰苯二胺10mg。溶解后，臨用前再加30% H2O2，40l。轉(zhuǎn)移緩沖液：