生物化學(xué)06蛋白質(zhì)研究技術(shù)課件

1、蛋白質(zhì)研究技術(shù)- 蛋白質(zhì)分離純化- 層析- 電泳- 氨基酸序列分析- 肽的化學(xué)合成(also suit forAA analysis)11. 蛋白質(zhì)分離純化 (separation & purification)三階段純化策略(純化所涉及的具體步驟最終要取決于樣品的性質(zhì)，但具有共同的可參考階段) - 捕獲階段 初步澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)/靶蛋白 - 中度純化階段 除去大多數(shù)雜質(zhì)，包括非靶蛋白及核酸等 - 精制階段 除去殘余的痕量雜質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)方法電荷(等電點(diǎn))離子交換分子量凝膠過(guò)濾疏水性疏水劑特異性結(jié)合親和試劑可依據(jù)蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)而采用不同的分離方法 2所用步驟及重復(fù)次數(shù)取決于純度要求和蛋白

2、的最終用途 32. 層析 (chromatography)- 逆流分溶原理Kd =q (動(dòng)相)p (靜相)分配系數(shù)：slowfast5- 離子交換層析 (電荷狀態(tài))- 混合物中不同組分對(duì)樹(shù)脂中帶電 基團(tuán)的親合力將受到溶液pH (決定 各組分的電離狀態(tài))和游離鹽離子 濃度的影響- 對(duì)陽(yáng)離子交換劑 親合力低(電負(fù)性 更強(qiáng))的組分流經(jīng) 層析柱的速度要相對(duì)更快一些- 與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合得最緊密(電 正性最強(qiáng))的組分則可通過(guò)采用鹽 濃度更高或不同pH的緩沖液將其 最后洗脫P(yáng)5-18aAAs elution order at pH 3: acidic (A0) neutral (A+) basic (A2

3、+)陽(yáng)離子交換劑的基質(zhì)為電負(fù)性，可交換陽(yáng)離子(cf. p25, Fig. 2-12 & 2-18)6- 分子篩/排阻層析(顆粒大小)- 親和/吸附層析(配體親和力)5-18b/c(cf. Fig. 2-19 & 2-20)(cf. Fig. 2-21)73. 電泳 (electrophoresis)帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身帶相反電荷的電極移動(dòng)之現(xiàn)象- 電泳介質(zhì)現(xiàn)多采用各種凝膠(eg. 瓊脂糖、丙烯酰胺等)- 介質(zhì)pH一般維持在堿性區(qū)，使蛋白質(zhì)大多帶負(fù)電荷而 向陽(yáng)極遷移- 蛋白質(zhì)遷移速率與其相對(duì)質(zhì)量和荷電狀態(tài)等密切相關(guān)(cf. p36)8- 等電聚焦電泳(IFE)利用特定兩性電解質(zhì)構(gòu)建的緩沖液

4、在電場(chǎng)作用下于凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向建立的pH梯度，使樣品中具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最終均遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處而達(dá)到分離之目的Ampholytes:例如脂肪族多胺多羧類(lèi)化合物的混合物 (cf. p37)104. 氨基酸序列分析Frederick Sanger (1918-)the only onewho got NP forChem. in twice(1958 & 1980)- 各種蛋白質(zhì)均具有其獨(dú)特的AA序列， 可決定多肽鏈以何種方式折疊、盤(pán)繞 成獨(dú)特的3D構(gòu)象(功能基礎(chǔ))- AA序列異常有可能導(dǎo)致遺傳病 (by 1 AA 1/3) eg. sickle cell anemia: 鏈Glu6

5、Val6- 不同物種的相似功能蛋白質(zhì)常具有 類(lèi)似的AA序列 (p45) eg. Ser-proteases的催化三聯(lián)體 泛蛋白的全部76 AA對(duì)果蠅 和人均完全相同(cf. p39)12氨肽酶法 AlaValGly羧肽酶法 - 肽鏈末端亦可用酶法測(cè)定(cf. p44)14- Edman法的測(cè)定長(zhǎng)度取決 于每輪循環(huán)降解的有效率以N-末端為Gly-Pro-Lys-的肽鏈為例，如果每輪循環(huán)切除的有效率為97%，則1st Gly Pro-Lys- 97% Gly-Pro-Lys- 3% cycle PTH-AA shortened peptide2nd Pro 97% Lys- 97% Gly 3%

6、Pro-Lys- 2.9% Gly-Pro-Lys- 0.1%3rd Lys 97% Pro 2.9% Gly 0.1%目前的降解有效率99%，可一次性連續(xù)測(cè)定出6070 AA序列的肽段Pehr Edman 1916-197715 大蛋白需分解成小肽段后再測(cè)序- 斷開(kāi)二硫鍵過(guò)甲酸氧化/二硫蘇糖醇還原- 分割多肽鏈 eg. 胰蛋白酶 + 溴化氰- 肽段測(cè)序 Edman降解法- 肽段整合 比較兩/多套肽段的重疊肽序列- 確定二硫鍵部位斷裂二硫鍵前、后的 電泳圖譜比較(cf. p39)在以常規(guī)法確定了完整肽鏈的AA組成(酸水解)和N-末端殘基(DNFB)的基礎(chǔ)上165-26Cys 斷開(kāi)二硫鍵- 過(guò)甲

7、酸氧化- 二硫蘇糖醇還原 + 碘乙酸保護(hù)(cf. p40 & Fig. 2-28)磺基丙氨酰(負(fù)電荷增加)17t5-7胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶溴化氰(CNBr)(cf. p41 & Tab. 2-2) 常用的分割肽鏈法分割原則：- 斷點(diǎn)少- 專(zhuān)性強(qiáng)- 反應(yīng)率高 肽酰高絲氨酸內(nèi)酯 (cf. Fig. 2-30)18 用互補(bǔ)DNA法推斷蛋白質(zhì)的AA序列待測(cè)定蛋白質(zhì)作為抗原抗 體合成抗原的多核糖體mRNAcDNA氨基酸序列mRNAProtein分離反轉(zhuǎn)錄測(cè)序推斷免疫處理沉淀20W1.11 多肽液相合成X常用芐氧甲?；鵜常用叔丁酯用PCl5激活參與肽鍵形成的羧基，現(xiàn)在多采用更溫和的疊氮、混合酸酐和

8、活化酯法Emil Fischer1852-1919(NP in Chemistry, 1902)5. 肽的化學(xué)合成21Protect a-amino group with Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl group) LINKAGE CAN BE CLEAVEDBY MILD BASE甲氧羰基芴(二苯并五環(huán)) P6-1223t5-8 化學(xué)合成肽的主要限制因素之一在于每輪合成的效率- 化學(xué)法合成出100 AA的肽段需要數(shù)天， 而(細(xì)菌)細(xì)胞的生物合成僅需 5 min24要點(diǎn)提示 (續(xù)1) 多肽的氨基酸序列可以通過(guò)Edman法降解確定； 大的多肽序列測(cè)定可利用蛋白酶

9、和化學(xué)試劑先 有選擇地水解成一些小肽段后再進(jìn)行，然后通過(guò) 比較兩套更多套具有交叉重疊肽段的序列而推斷 出整條多肽鏈的氨基酸序列261) 分子篩/排阻層析與SDS的基本原理都是按照多肽鏈 的相對(duì)質(zhì)量進(jìn)行分離的，但為什么大、小分子的分離順序 正好相反？2) 通過(guò)分子排阻層析確定了某一純化蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為 60 kD，在有尿素存在的條件下進(jìn)行層析可產(chǎn)生單一的 30 kD產(chǎn)物，但在有尿素和巰基乙醇同時(shí)存在時(shí)的層析 結(jié)果卻是單一的15 kD產(chǎn)物。試分析該分子的結(jié)構(gòu)如何？3) 有一個(gè)七肽，經(jīng)分析其氨基酸組成為：Lys, Leu, Arg, Phe, Ala, Tyr和Ser；未經(jīng)蛋白酶處理時(shí)，該七肽與FDNB反應(yīng)不 產(chǎn)生-DNP-AA；經(jīng)糜蛋白酶作用后斷裂成兩個(gè)肽段，其氨 基酸組成分別為Ala, Tyr, Ser和Leu, Phe, Lys, Arg；這兩個(gè) 肽段與FDNB反應(yīng)可分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys；該七肽 與胰蛋白酶反應(yīng)亦產(chǎn)生兩個(gè)肽段，其氨基酸組成分別