蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)

1、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)（DE technology of Protein）第1頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù) DE（directed evolution of protein）始于上世紀(jì)70年代，最早一個(gè)例子是進(jìn)化一個(gè)起源于大腸桿菌 E b g A蛋白， 這個(gè)酶幾乎不具備 -半乳糖苷酶活性。經(jīng)過以乳糖為單一碳源平板上篩選 L a c- 缺失大腸菌株 ，野生型 E b g A就進(jìn)化成為了含有 - 半乳糖苷酶活性酶。第2頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)定義（definition）原理（theory）隨機(jī)突變策略（marked features）定向進(jìn)化選擇策略（methods）應(yīng)用及展望（application and p

2、rospects） 第3頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)定義 定向進(jìn)化技術(shù)是一個(gè)在生物體體外 ( 試管中) 模擬達(dá)爾文進(jìn)化 ，利用自然選擇動(dòng)力進(jìn)化出在自然界并不存在或是含有更優(yōu)性質(zhì)蛋白。第4頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù) 生物在漫長時(shí)間里經(jīng)過自發(fā)突變（突變與重組），經(jīng)過自然選擇，逐步形成了多樣性生物。自然選擇自發(fā)、不定向、自然選擇、慢分子定向進(jìn)化 基因在短時(shí)間內(nèi)經(jīng)過人為引發(fā)突變，經(jīng)過人工篩選，形成滿足人們需要新功效或者優(yōu)良性能生物物質(zhì)（酶蛋白）人為、定向、人工選擇、快第5頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)原理DE原理是對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行突變、重組、表示和篩選,在試管內(nèi)模擬蛋白質(zhì)自然進(jìn)化過程, 獲取人們需要、含有特定性質(zhì)和功效蛋白質(zhì)。

3、定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇第6頁 隨機(jī)突變策略易錯(cuò) PCR DNA改組和外顯子改組 雜合蛋白質(zhì)體外隨機(jī)引發(fā)重組交織延伸第7頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)易錯(cuò) P C R易錯(cuò) P C R是指經(jīng)過改變 P C R反應(yīng) 條件，如： 調(diào)整反應(yīng)體系中4種 d NTP濃度、增加Mg 2+ 濃度等，使堿基在一定程度上隨機(jī)錯(cuò)配而引入多點(diǎn)突變，構(gòu)建突變庫，刷出所需突變體。易錯(cuò) P C R關(guān)鍵是控制D N A突變頻率。第8頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)DNA改組 DNA改組又稱有性PCR，目標(biāo)是創(chuàng)造將親本基因群中突變盡可能組合機(jī)會(huì)，造成更大變異，最終取得最正確突變組合蛋白質(zhì)。第9頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)雜合蛋白質(zhì) 把不一樣蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)單

4、元或整個(gè)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生含有所需性質(zhì)優(yōu)化蛋白質(zhì)雜合體。第10頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)體外隨機(jī)引發(fā)重組 以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不一樣位點(diǎn)短DNA片段，因?yàn)閴A基錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少許點(diǎn)突變，在隨即PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整基因長度。第11頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)交織延伸 一個(gè)簡化 D N A 重組方法，它不是由短片段組裝全長基因，而是在 PCR反應(yīng)中，將含不一樣點(diǎn)突變模板混合，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性及延伸反應(yīng)，在每一輪中，那些部分延伸片段能夠隨機(jī)地雜交到含不一樣突變模板上繼續(xù)延伸，因?yàn)槟０遛D(zhuǎn)換

5、而實(shí)現(xiàn)不一樣模板間重組，如此重復(fù)直至取得全長基因片段。第12頁定向進(jìn)化選擇策略 Venekei等人報(bào)道了有效快速篩選蛋白水解酶突變體方法和篩選條件，主要是利用蛋白酶選擇平板初選，再配合活性染色和X-光片毀滅分析加以驗(yàn)證，并檢測其活力快速篩選了44000個(gè)突變株。Roberts等人用嗜菌體表面展現(xiàn)技術(shù)篩選與嗜中性酯酶結(jié)協(xié)力更強(qiáng)抑制劑。從含有4900個(gè)突變體基因庫中，取得與該酶結(jié)合能力高于野生蛋白質(zhì)3600000倍突變體，比已報(bào)道任何一個(gè)對(duì)應(yīng)抑制劑高50倍。第13頁定向進(jìn)化展望 不但能使蛋白質(zhì)進(jìn)化出非天然特征，還能定向進(jìn)化某一代謝路徑；不但能進(jìn)化出含有單一優(yōu)良特征蛋白質(zhì)，還可能是已分別優(yōu)化蛋白質(zhì)兩

6、個(gè)或多個(gè)特征疊加，產(chǎn)生含有多項(xiàng)優(yōu)化功效蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)展和豐富蛋白質(zhì)資源；完全在試管中進(jìn)行蛋白質(zhì)體外定向進(jìn)化使在自然界需要幾百萬年進(jìn)化過程縮短至幾年。第14頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化應(yīng)用及展望提升酶催化活性 提升酶穩(wěn)定性 改變酶底物特異性 改變對(duì)映異構(gòu)體特異性第15頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)提高酶催化活性 Shim 等采取定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變體 ，改變了位于酶活性中心 “蛋白-s -結(jié)合 ” 口袋中 Me t -3 1 7 ，并突變?yōu)锳la ，從而有利于底物范圍擴(kuò)大； Potocki Veronese等利用易錯(cuò) P C R和 DNA 重組技術(shù)對(duì)其 進(jìn)行突變 ，得到催化蔗糖活性提升 6 0 突變體 A s n 3

7、 8 7 A s p ，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，在實(shí)際生產(chǎn)中含有主要意義 。第16頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)第17頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)提升酶穩(wěn)定性 Xiao等利用序列比正確結(jié)果為指導(dǎo)，進(jìn)行定點(diǎn)突變 ，得到突變體 Tm值提升了 6 ，同時(shí)在不影響原有催化活性基礎(chǔ)上，在 45 時(shí)半衰期比原酶提升了23倍之多。 Miyazaki 等為了適應(yīng)生產(chǎn)化需要 ，綜合了隨機(jī)突變、定點(diǎn)飽和突變和 DN A 重組方法 ，將 11家族木聚糖酶進(jìn)行改造以提升其熱穩(wěn)定性。最終得到突變體半熱變性溫度從 58 提升到 68，最適溫度也從 55 升到了 65 ，同時(shí)在 60 熱穩(wěn)定性也顯著增強(qiáng)。第18頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)改變酶底物特異

8、性 Manu等經(jīng)過對(duì)纖維二糖磷酸化酶 (CP) 進(jìn)行易錯(cuò) P C R篩選 ，得到突變株作用底物從傳統(tǒng)纖維二糖轉(zhuǎn)變成了乳糖 ，隨即提升了乳糖磷酸化酶活性。最終得到突變體菌株乳糖磷酸化酶活性比原酶高出了1 0倍 。 第19頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù) 改變對(duì)映異構(gòu)體特異性（1）Schmidt 等選取易錯(cuò) P C R技術(shù)未起源于 Pseudomonas fluoresce 酯酶對(duì)應(yīng)選擇性野生型E值從 63提升至 96 ，同時(shí)活性也對(duì)應(yīng)增加了， 能夠到達(dá) 2 mi n轉(zhuǎn)化 50 底物， 相當(dāng)于 125 Umg 蛋白量。第20頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)（2）1998年，Arnold等利用易錯(cuò)PCR和飽和誘變 方法 ，

9、成功地使一株傾向于 D -型底物乙內(nèi)酰脲酶發(fā)生轉(zhuǎn)變 ，使之變?yōu)閮A向于 L - 型底物，經(jīng)過分析這種轉(zhuǎn)變只生發(fā)了一個(gè)氨基酸替換 。與野生型催化蛋白相比，增加了 L - 甲硫氨酸產(chǎn)量，降低了無須要產(chǎn)物積累。第21頁實(shí)際用途在新藥和疫苗開發(fā)中應(yīng)用在改進(jìn)單鏈抗體親和力方面應(yīng)用在酶制劑改造中應(yīng)用構(gòu)建大型文庫和獲取分子有力工具在化學(xué)品生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用 第22頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)第23頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù) Luginbuhl等用易錯(cuò) PCR 和 DNA改組方法, 進(jìn)行了幾個(gè)回合 DE和用核糖體展示抗體庫技術(shù)進(jìn)行篩選后發(fā)覺, 得到抗體與朊病毒肽鏈非結(jié)構(gòu)化區(qū)域親和力增加.第24頁蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù) Kikuchi 等借助DNA改組方法提升了根癌農(nóng)桿菌 N-氮基甲酰D-氨基酸酰胺水解酶氧穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，使 N-氨基甲酰-D