蛋白質(zhì)的提取與分離純化-生化實驗設(shè)計講解課件

1、 生化實驗設(shè)計 蛋白質(zhì)的提取與分離純化主講人：第三組組員：華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院 已知某蛋白的分子量約為17 kDa，等電點3.94.1，它能耐一定的高溫，在90 C加熱34 min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露它的疏水基團。該蛋白的作用是作為生物體內(nèi)酶的激活劑。請設(shè)計一個從腦組織中提取和分離純化該蛋白的實驗方案，要求寫出具體的步驟和理由，以及檢測方法。文獻查得： 鈣調(diào)蛋白（CaM）是由148個氨基酸組成的單鏈分子,其pI值在3.9-4.1之間,分子量約為17KDa.該蛋白能夠耐一定的高溫，在90oC加熱3-4min后仍然能夠保持80%的活性。該

2、蛋白分子中含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露出它的疏水基團。整個實驗過程一般可分為 5 個階段： 材料的選擇和預(yù)處理 細(xì)胞的破碎（有時需進行細(xì)胞器的分離）提取 純化（包括等電點沉降法，鹽析，有機溶劑沉淀，吸附、層析、等）分析鑒定。一、材料的選定：大鼠腦組織 預(yù)處理： 將切取的組織用4預(yù) 冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS（磷酸鹽緩沖液 ） 。實驗步驟：玻璃勻漿機b、細(xì)胞器的分離 細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法。細(xì)胞經(jīng)過破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進行差速離心。三、蛋白質(zhì)粗提取原理：利用蛋白質(zhì)在PH等電點時的溶解度最小，因而會以沉淀的方式析出。試劑：檸檬酸、磷

3、酸氫二鈉步驟：1向試管中加入磷酸氫二鈉和檸檬酸，使其PH=4。2將提取的溶液加入到第1步驟所配的緩沖液中。3靜置一段時間，待沉淀完全。4過濾或離心出粗產(chǎn)品。注意事項：防止局部過酸或過堿造成蛋白質(zhì)變性。金屬螯合親和層析 固定化金屬螯合親和層析是建立在蛋白質(zhì)表面的氨基酸與固定化金屬離子的親和力的不同來進行蛋白質(zhì)分離的一項技術(shù)。過渡態(tài)金屬離子能夠與電子供體，如氮、硫、氧等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點，當(dāng)它在溶液中會被水分子或陰離子占據(jù)。 鈣調(diào)蛋白的外形似啞鈴,有兩個球形的末端,中間被一個長而富有彈性的螺旋結(jié)構(gòu)相連,每個末端有兩個Ca2+ 結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一個C

4、a2+ , 這樣,一個鈣調(diào)蛋白可以結(jié)合4個Ca2+ ,鈣調(diào)蛋白與Ca2+ 結(jié)合后的構(gòu)型相當(dāng)穩(wěn)定 。四、精細(xì)純化值得注意的是，在洗脫時，會有少許配基與蛋白質(zhì)一同被洗脫下來，因此常在其后加一凝膠層析以除去小分子的配基。 凝膠層析法屬最常用的蛋白質(zhì)分離方法。系混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。在洗柱過程中，分子量最大的物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質(zhì)因能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。 當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式： logMW=K-bX， 式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。B、定量分析紫外檢測法、考馬斯亮藍(lán)法、Folin-酚試劑法（最常用方法）Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin 試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為5100g 蛋白質(zhì)。Folin 試劑