馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效液相色譜

1、測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法國家標準編制說明目錄 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark0 o Current Document 1任務來源3 HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 2起草的目的意義3 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 2.1茄尼醇相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要4 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 2.2完善國家標準的需要4 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 3茄尼醇研究、

2、應用與標準現(xiàn)狀43.1茄尼醇研究43.2茄尼醇檢測方法53.3茄尼醇標準54主要起草過程6 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 4.1成立標準制定工作組64.2確定工作計劃和標準制定原則6 HYPERLINK l bookmark12 o Current Document 4.3杳詢國內(nèi)外相關(guān)標準和文獻資料7 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 4.4研究建立標準方法，開展條件實驗74.5方法驗證7 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 4.6形成標準討

3、論稿和編制說明8 HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 4.7形成標準草案8 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 4.8形成標準征求意見稿和編制說明8 HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 4.9征求意見并形成標準送審稿和編制說明9 HYPERLINK l bookmark24 o Current Document 5本標準與國內(nèi)外分析方法的關(guān)系9 HYPERLINK l bookmark26 o Current Document 6主要技術(shù)指標依據(jù)與說明

4、96.1標準名稱9 HYPERLINK l bookmark28 o Current Document 6.2前言96.3主體內(nèi)容10 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 6.4“范圍”的界定10 HYPERLINK l bookmark32 o Current Document 6.5原理10試齊U10儀器和設備11 HYPERLINK l bookmark40 o Current Document 6.8馬鈴薯葉試樣處理11 HYPERLINK l bookmark42 o Current Document 6.9馬鈴薯葉提取物（提取液）試樣

5、處理126.10檢測方法12 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 6.10.1色譜質(zhì)譜條件12 HYPERLINK l bookmark56 o Current Document 6.10.2標準曲線136.10.3精密度和穩(wěn)定性15 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 6.10.4方法的準確度166.10.5方法的檢出限和定量限17 HYPERLINK l bookmark64 o Current Document 6.10.6方法驗證17 HYPERLINK l bookmark66 o Cur

6、rent Document 6.10.7 小結(jié)17 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 7.采用國際標準和國外先進標準程度，以及與國際、國外同類標準水平的對比情況18 HYPERLINK l bookmark72 o Current Document 8與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準的關(guān)系18 HYPERLINK l bookmark74 o Current Document 9標準作為強制性或推薦性標準的意見18 HYPERLINK l bookmark76 o Current Document 10實施標準的建議18 HYPERLINK l bo

7、okmark78 o Current Document 11參考文獻181 任務來源本國家標準的制定任務是根據(jù)國家標準化管理委員會下達的國家標準制定 計劃馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法項 目（計劃號為20193348-T-424）起草。本項目為2017年國家重點研發(fā)計劃NQI 項目主要農(nóng)業(yè)廢棄物提取加工與功效評價標準研究（2017YFF0207800）中 一個任務。國家標準計劃馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效液 相色譜-質(zhì)譜法由中國計量大學上報，中國標準化研究院歸口及執(zhí)行，主管部 門為國家市場監(jiān)督管理總局。本標準由中國計量大學、中國標準化研究院、北 京

8、信息職業(yè)技術(shù)學院、云南農(nóng)業(yè)大學、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心、河 北冠卓檢測科技股份有限公司共同起草。本標準主要起草人：馬正、蘭韜、席 興軍、陳亮、初僑、田洋、陽新鳳、張敬軒、于聰聰、李忍。2起草的目的意義馬鈴薯作為全球第四大糧食作物，僅次于小麥、稻谷和玉米1。近年來，我 國馬鈴薯生產(chǎn)快速發(fā)展，已初步形成了北方一作區(qū)、中原和南方二作區(qū)及西南 一二季混作區(qū)的種植模式，覆蓋我國大部分省區(qū)市，常年種植面積穩(wěn)定在8500 萬畝左右，總產(chǎn)量保持在 9000 萬噸以上2。馬鈴薯葉是馬鈴薯的地上部分，其 產(chǎn)量與馬鈴薯塊莖相當，即年產(chǎn)量也在 9000 萬噸左右。馬鈴薯葉作為一種青綠 色的農(nóng)副產(chǎn)品，具有一定的

9、營養(yǎng)價值，但由于其龍葵素含量高 3，適口性差， 限制了馬鈴薯葉作為飼料在養(yǎng)殖業(yè)中的利用，這不僅造成了資源浪費，同時還 污染了環(huán)境。馬鈴薯收獲時，其莖葉多為青綠色，具有較高的營養(yǎng)價值，尤其是粗蛋白質(zhì) 含量較高。據(jù)測定，馬鈴薯葉的水分含量為 85%- 92%，其干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)含 量為 11%-26%、中性洗滌纖維含量為 28%-47%、粗脂肪為 2.5%-4.8%、粗灰分 為 9.5%-16.8%、鈣含量為 1.4%-1.9%、磷含量為 0.19%-0.36%。更為重要的是 馬鈴薯葉中還具有一些獨特的生物活性物質(zhì)，如茄尼醇、綠原酸、色素、黃酮 類物質(zhì)、酚酸類物質(zhì)等4。其中以茄尼醇在馬鈴薯葉中含量

10、較高（ 0.1%-1%）、 用途廣泛而被大量研究5-7。茄尼醇相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要茄尼醇是一種不飽和的九聚異戊二烯伯醇，屬四倍半萜烯醇，具有獨特的鏈 狀隔離多烯結(jié)構(gòu)，是合成多種心血管疾病治療藥物、抗癌藥物和抗?jié)兯幬锏?重要中間體，如合成輔酶Q10、維生素K2和抗癌增效劑SBD等8 9。茄尼醇本 身還具有抗菌、消炎和止血等作用。所以從馬鈴薯葉中提取茄尼醇是其資源化 利用的有效途徑之一。目前以茄尼醇為主要成分的提取物主要有茄尼醇提取物 和提取液兩種浸膏形式，大多為粗提物。西安清爍進出口貿(mào)易有限公司生產(chǎn)的 茄尼醇提取物和茄尼醇提取液廣銷國外。而為了更好的資源化利用馬鈴薯葉中 的茄尼醇，同時為了做

11、好茄尼醇提取物相關(guān)制品的質(zhì)量控制，首先需要對馬鈴 薯葉中的茄尼醇進行準確、高靈敏的檢測，即需要發(fā)展普適性好、準確度高、 高靈敏度的檢測方法。完善國家標準的需要經(jīng)查詢，目前 ISO、 AOAC 的相關(guān)標準中都沒有馬鈴薯莖葉及其加工制品 中茄尼醇含量測定方法的相關(guān)標準。而我國國家標準中有一項10與之相關(guān)，為 煙葉和煙葉提取物中茄尼醇的測定 高效液相色譜法(GB/T 31758-2015), 該標準針對煙葉、煙膏、煙葉提取液中游離茄尼醇和總茄尼醇的含量給出了明 確的測定方法，并對該方法對煙葉、煙膏、煙葉提取液中茄尼醇的檢出限和定 量限進行了說明。該方法對于煙葉中游離茄尼醇和總茄尼醇含量的檢出限為 0

12、.0013 mg/g，煙膏中游離茄尼醇和總茄尼醇含量的檢出限為0.0013 mg/g，提取 液中游離茄尼醇和總茄尼醇含量的檢出限為0.000052 mg/g。由于馬鈴薯莖葉及其加工制品中茄尼醇含量通常較少，通常所使用的高效 液相色譜法存在檢測靈敏度接近馬鈴薯莖葉提取物中茄尼醇的下限的問題，難 以實現(xiàn)馬鈴薯莖葉提取物中茄尼醇含量的準確測定。而高效液相色譜-質(zhì)譜法具 有較高的靈敏度，可以實現(xiàn)馬鈴薯莖葉提取物中茄尼醇含量的準確測定。3 茄尼醇研究、應用與標準現(xiàn)狀3.1茄尼醇研究國內(nèi)外對茄尼醇的研究已經(jīng)十分廣泛，可查詢到大量的論文與專利，研究范 圍包括提取分離、純品制備、分析檢測、結(jié)構(gòu)表征、藥理活性、

13、毒性、分子結(jié)構(gòu)改性、產(chǎn)品加工等方面。3.2 茄尼醇檢測方法目前對馬鈴薯葉中的茄尼醇的檢測方法主要包括高效液相色譜 -質(zhì)譜法 11-14、高效液相色譜法15, 16、薄層色譜法17等方法，其中高效液相色譜法應用 較多，如沈建偉等15應用液相色譜法建立了馬鈴薯葉提取物中茄尼醇含量的測 定方法，該方法線性范圍為0.13 ppm-0.46 ppm，平均回收率為98.2%, RSD值 為 1.32%，具有良好的精密度和準確性，適用于茄尼醇產(chǎn)品中茄尼醇含量的測 定。楊玲娟等16建立了反相高效液相色譜法測定馬鈴薯葉中茄尼醇的分析方法， 并采用微波輻射法進行樣品前處理，大大提高了樣品的提取效率并減少了提取 溶

14、劑消耗，該方法線性范圍為6.125 pg/mL-196卩g/mL，平均加樣回收率為 99.04%， RSD 值為 1.87%。薄層色譜法也有較多應用，如賈海紅等17發(fā)展了薄 層掃描測定馬鈴薯葉中茄尼醇的方法，方法的回收率為 92.6%-97.1%，方法相 對標準偏差為2.17%-2.59%，最低檢測限為0.15 ug。這些方法都具有簡便、快 速、實用等優(yōu)點，但都存在檢測靈敏度接近馬鈴薯葉提取物中茄尼醇的下限， 難以實現(xiàn)馬鈴薯葉提取物中茄尼醇含量的準確測定。而高效液相色譜-質(zhì)譜法具 有較高的靈敏度，如石小鵬等14建立了馬鈴薯葉中茄尼醇含量的高效液相色譜- 質(zhì)譜檢測方法，方法的線性范圍為0.006

15、 pg/mL-114.0 yg/mL，可以實現(xiàn)馬鈴薯 葉提取物中茄尼醇含量的準確測定。因此，制訂簡單可信的馬鈴薯葉中茄尼醇 含量的高效液相色譜-質(zhì)譜檢測方法標準具有十分重要的現(xiàn)實意義和緊迫性。 3.3茄尼醇標準經(jīng)查詢，目前ISO、AOAC的相關(guān)標準中都沒有馬鈴薯葉及其加工制品中 茄尼醇含量測定方法的相關(guān)標準。而我國國家標準中有一項與之相關(guān)，為煙葉和煙葉提取物中茄尼醇的測定 高效液相色譜法(GB/T 31758-2015)，該標準針對煙葉、煙膏、煙葉提取液中 游離茄尼醇和總茄尼醇的含量給出了明確的測定方法，并對該方法對煙葉、煙 膏、煙葉提取液中茄尼醇的檢出限和定量限進行了說明。該方法對于煙葉中游

16、 離茄尼醇和總茄尼醇含量的檢出限為0.0013 mg/g，煙膏中游離茄尼醇和總茄尼 醇含量的檢出限為0.0013 mg/g，提取液中游離茄尼醇和總茄尼醇含量的檢出限 為 0.000052 mg/g。由于馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量通常較少，通常所使用的高效液相 色譜法存在檢測靈敏度接近馬鈴薯葉提取物中茄尼醇的下限的問題，難以實現(xiàn) 馬鈴薯葉提取物中茄尼醇含量的準確測定。而高效液相色譜-質(zhì)譜法具有較高的 靈敏度，可以實現(xiàn)馬鈴薯葉提取物中茄尼醇含量的準確測定。因此，有必要盡快制定馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效 液相色譜-質(zhì)譜法國家標準，以滿足相關(guān)企業(yè)和檢測、管理結(jié)構(gòu)的需要。 4主要

17、起草過程4.1 成立標準制定工作組國家重點研發(fā)項目立項后，2017 年 11 月 10 日在北京市西藏大廈召開了國 家標準馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法 第一次工作會。參加單位有中國計量大學、中國標準化研究院、北京信息職業(yè) 技術(shù)學院、云南農(nóng)業(yè)大學、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心、河北冠卓檢測 科技股份有限公司、浙江大學、中華全國供銷合作總社天津再生資源研究所等。 會議成立了由中國計量大學、中國標準化研究院、北京信息職業(yè)技術(shù)學院、云 南農(nóng)業(yè)大學、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心、河北冠卓檢測科技股份有限 公司等單位參加的標準工作組，主要由從事標準制修訂、儀器分析、具有

18、豐富 技術(shù)經(jīng)驗的專業(yè)研究人員組成，工作組制定了初步的標準編制工作計劃。 4.2確定工作計劃和標準制定原則按照工作任務要求，工作組制定了標準起草工作計劃和任務分工。 在充分研究與討論的基礎上，制定了標準制定原則：（1）先進性：其準確度、精密度和靈敏度達到較高水平。（2）適用性：要適應我國植物提取物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求，滿足植物提取物現(xiàn) 代化的需要。（3）可操作性：符合我國目前檢測儀器設備和試劑、材料的供應條件。（4）實用性：符合檢測從業(yè)人員的技術(shù)水平，能被國內(nèi)主要的環(huán)境分析實 驗室所使用并達到所規(guī)定的要求。要有利于提高農(nóng)業(yè)廢棄物綜合利用，為植物 提取物質(zhì)量控制部門、有關(guān)企業(yè)和三農(nóng)服務。4.3查詢國內(nèi)外

19、相關(guān)標準和文獻資料2018年，開始開展“馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效液相 色譜-質(zhì)譜法”方法研究。由于在現(xiàn)行國家標準、行業(yè)標準、地方標準、團體標 準和企業(yè)標準中，均無相應的測定方法標準，與之相關(guān)的只有一個煙葉和煙 葉提取物中茄尼醇的測定 高效液相色譜法的測定茄尼醇的標準方法，所以 我們查閱相關(guān)文獻，分析茄尼醇的結(jié)構(gòu)特點，茄尼醇屬于四倍半萜烯醇，具有 九個連續(xù)的雙鍵的獨特結(jié)構(gòu)。高效液相色譜-質(zhì)譜法具有準確度好、精密度高、檢出限與定量限低、操作 簡單等優(yōu)點，因此確定采用液相色譜-質(zhì)譜法檢測馬鈴薯葉中提取的茄尼醇。借 鑒煙葉和煙葉提取物中茄尼醇的測定 高效液相色譜法中茄尼醇的提取方

20、法，以馬鈴薯葉為樣品，經(jīng)過初步試驗，證明方法是可行的。而后對方法進行 優(yōu)化，對方法進行驗證，結(jié)果表明方法的準確性、回收率、精密度等方面都能 達到國家可標準的要求，并且基本符合制定國家標準的條件，并于2018 年向國 家標準化管理委員會提出立項申請。4.4 研究建立標準方法，開展條件實驗標準工作組按照計劃任務書的要求，結(jié)合制定標準的要求，研究建立標準 方法的實驗方案，并進行方法前處理條件的選擇、儀器條件的確定和方法精密 度、準確度及檢出限的測定等試驗。2018 年 3 月開始，標準起草工作組赴云南省昆明市進行馬鈴薯主產(chǎn)地進行 調(diào)研，獲取了大量相關(guān)信息與數(shù)據(jù)。2018 年 3 月 27 日從朱有勇

21、教授的馬鈴薯 基地采集很多馬鈴薯葉，作為茄尼醇提取的原料。原料樣品采集后，開始開展實驗室驗證工作，建立馬鈴薯葉中茄尼醇的高效 液相色譜-質(zhì)譜分析方法，包括線性范圍、相關(guān)系數(shù)、加標回收率、準確度、精 密度、檢出限、定量限等，以及樣品中茄尼醇的提取條件的摸索與優(yōu)化，如提 取溶劑種類、提取溶劑體積、超聲提取時間等。4.5 方法驗證2020年13月，由5家單位對“馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量的測 定 高效液相色譜 - 質(zhì)譜法”進行驗證，分別是 . 。，通過統(tǒng)計檢驗技術(shù)確認外部 實驗室試驗結(jié)果的準確性。4.6形成標準討論稿和編制說明2019 年 7 月 5 日，起草工作組組織相關(guān)單位和專家，在山東青

22、島中國科學 院蘭州化學物理研究所召開第二次標準起草工作會。參會單位包括中國標準化 研究院、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院、中國科學院蘭州化學物理研究所、北京化工大 學、浙江大學、北京信息職業(yè)技術(shù)學院、云南農(nóng)業(yè)大學、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 分析測試中心、河北冠卓檢測科技股份有限公司等。與會專家對馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量的測定 高效液相色譜 - 質(zhì)譜法標準草案中的英文名稱、范圍、術(shù)語和定義、基本要求、主要技術(shù)指 標、附錄等章條提出了詳細的意見，會后根據(jù)修改意見形成了馬鈴薯葉及其 加工制品中茄尼醇含量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法標準討論稿及其編制說 明。4.7形成標準草案標準起草工作組查閱、收集和整理了國內(nèi)

23、外有關(guān)研究進展和專利、標準、法 規(guī)等文獻資料，掌握了相關(guān)標準的現(xiàn)狀；對文獻中芒果苷測定方法進行了對比 和總結(jié)，為標準文本的編制奠定理論基礎。在馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼 醇含量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法國家標準第一次起草工作會議的基礎上， 起草工作組相關(guān)單位共同討論起草形成了馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含 量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法國家標準的技術(shù)框架和主要內(nèi)容，初步形成 了馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法標準 草案。4.8形成標準征求意見稿和編制說明在前期工作的基礎上，起草工作組組織相關(guān)單位和專家于 2019 年 10 月 22 日在北京中國標準化研究院召開第

24、三次標準起草工作會。參會單位包括中國熱 帶農(nóng)業(yè)科學院、中國標準化研究院、北京化工大學、浙江大學等。與會成員認 真討論馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法 標準討論稿后，根據(jù)討論結(jié)果修改形成了馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含 量的測定 高效液相色譜-質(zhì)譜法征求意見稿及編制說明。會議同時討論了下 一階段征求意見的單位和專家名單。4.9征求意見并形成標準送審稿和編制說明2020 年 4 月 1 日-2020年 5 月 31 日，起草工作組根據(jù)討論的專家和單位名 單，分別向相關(guān)的行業(yè)主管部門、科研機構(gòu)、檢測部門和企業(yè)等X個單位和專 家發(fā)出了標準征求意見稿，向相關(guān)單位和專家征求標準

25、修改意見。截止到 2020 年X月X日，共收集到等X家科研機構(gòu)、檢測機構(gòu)、管理部門、生產(chǎn)企業(yè) 等單位提出的反饋意見X條。5 本標準與國內(nèi)外分析方法的關(guān)系本標準研究旨在建立一項滿足我國常見植物馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼 醇含量檢測的要求，在質(zhì)量控制目標和技術(shù)手段上與國際接軌，適應我國大部 分質(zhì)控實驗室儀器設備和技術(shù)能力的檢測方法標準。通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻 資料，制定條件優(yōu)化方案，確保本方法前處理所采用的裝置操作簡便，能夠滿 足國內(nèi)實驗室的條件要求。本標準擬采用高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS） 測定茄尼醇。樣品的前處理，即馬鈴薯葉中茄尼醇的提取采用超聲法，并對超 聲時間、提取溶劑種類、提取

26、次數(shù)等因素進行優(yōu)化；檢測方法參考煙葉和煙 葉提取物中茄尼醇的測定 高效液相色譜法中茄尼醇的檢測方法及其他文獻 資料，選擇合適的色譜柱以及儀器條件。力求方法在穩(wěn)定、可靠和實用的基礎 上，達到國際先進水平，以適應我國馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量檢測、 質(zhì)控與管理的需要。6主要技術(shù)指標依據(jù)與說明標準名稱本標準主要解決馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量測定的技術(shù)問題，所 以將本標準的名稱定為：馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇的含量測定 高效液 相色譜-質(zhì)譜法，翻譯為“ Determination of Solanesol in potato leaves and its processed produc

27、ts High performance liquid chromatography- massspectrometry”。前言明確了本標準的歸口單位及主要起草單位、起草人。6.3 主體內(nèi)容標準的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器和設備、 測定步驟、結(jié)果計算與表示、精密度和回收率、檢驗報告等。6.4“范圍”的界定本標準規(guī)定了馬鈴薯葉及其加工制品中總茄尼醇含量的高效液相色譜 -質(zhì)譜 測定方法。本標準適用于馬鈴薯葉及馬鈴薯葉提取物中總茄尼醇含量的測定本方法測定馬鈴薯葉中總茄尼醇含量的檢出限為mg/g,定量限為mg/g； 15%提取液中總茄尼醇含量的檢出限為mg/g，定量限為mg/g

28、； 70%提取液中 總茄尼醇含量的檢出限為mg/g，定量限為mg/g。6.5 原理用正己烷提取馬鈴薯葉中的茄尼醇（包含酯態(tài)）,總茄尼醇需用氫氧化鈉皂 化以釋放出結(jié)合態(tài)的茄尼醇,然后用水去除雜質(zhì),離心分離,取上層溶液用流 動相稀釋定容,經(jīng)微膜過濾后用高效液相色譜-質(zhì)譜儀測定,外標法定量計算。 6.6 試劑6.6.1正己烷（C6H14）:分析純。6.6.2甲醇（CH4O）:色譜純。6.6.3異丙醇（C3H8O）:色譜純。6.6.4氫氧化鈉（NaOH）:分析純。6.6.5無水乙醇（C2H6O ）分析純。6.6.6茄尼醇標準品：純度99%。NaOH乙醇溶液（0.02 mol/L）:稱取0.4 g氫氧化

29、鈉（6.6.4），溶于無水 乙醇（6.6.5），用無水乙醇稀釋至500mL，儲存于聚乙烯瓶中，旋緊瓶蓋。流動相:甲醇（6.6.2）:異丙醇（6.6.3） =50: 50（體積比），使用前經(jīng)濾 膜過濾,超聲脫氣。6.6.9茄尼醇標準儲備液（500 Ug/mL）:稱取50 mg茄尼醇標準品（6.6.6）, 至于100 mL容量瓶種，精確至0.0001g，用正己烷（6.6.1）溶解并定容至刻度 線，混勻。標準儲備溶液避光保存于4C冰箱備用，有效期3個月。6.6.10 茄尼醇系列標準工作溶液：分別準確移取0.01 mL、0.5 mL、1.0 mL、5.0 mL茄尼醇標準儲備溶液（6.6.9）于不同的5

30、0 mL容量瓶9中，用流動相（6.6.8） 稀釋至定容刻度線，搖勻，得到茄尼醇系列標準工作溶液（質(zhì)量濃度分別為0.1 yg/mL、1 yg/mL、5 yg/mL、10 yg/mL、50 yg/mL）。6.6.11除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應符合GB/T6682中一級水的 要求。6.7儀器和設備6.7.1濾膜：0.22 ym,直徑25 mm的有機系濾膜或者相當者。渦旋振蕩器。6.7.3超聲波清洗器：功率不低于250 W,或相當?shù)脑O備6.7.3離心機：不低于4000 r/min,或相當?shù)脑O備。6.7.4恒溫振蕩器：可水浴加熱（0C100C）。高效液相色譜-質(zhì)譜儀： ACCELA 高效液

31、相色譜儀、 TSQ Quantum Access MAX 三重四極桿質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）電子天平：感量0.0001 g。6.7.7離心管：50 mL （螺旋蓋），10 mL （具塞）。6.7.8 容量瓶：100 mL, 50 mL, 25 mL （棕色）。6.7.9三角瓶：100 mL （具塞、棕色）。6.8馬鈴薯葉試樣處理樣品為馬鈴薯葉時,稱取約 1 g 馬鈴薯葉試樣于 50 mL 離心管中,精確至 0.0001 g,加入30 mL正己烷，用渦旋振蕩器渦旋振蕩2 min,旋緊蓋子，靜置 30 min后，用超聲波清洗器于45 C超聲波萃取中。再分2次各用10 mL正己 烷重復以上振

32、蕩、萃取和離心步驟,合并上層正己烷層于 50 mL 容量瓶中,用 正己烷定容至刻度線,搖勻。準確移取4 mL 提取液于 100 mL 三角瓶中,加入 4 mL NaOH乙醇溶液，充分混勻，輕塞塞子，在恒溫振蕩器中6065 C水浴振 蕩、皂化2 h；皂化后溶液在8387 C水浴蒸發(fā)至近干；準確移取2 mL正己烷 于上述三角瓶中，超聲 2min 溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至另一潔凈 10 mL 離心管中。重復以上自“準確移取 2 mL 正己烷”起按照正確的操作規(guī)程，溶解三角瓶 中殘留物轉(zhuǎn)移至離心管中，再用約6 mL 水，每次 2 mL 分三次洗滌三角瓶，合 并溶液于離心管中；渦旋振蕩器離心管 2 min 以去

33、除水溶性雜質(zhì)，離心 10 min 分層；準確移取 1 mL 凈化后上層正己烷提取液，用流動相稀釋合適的倍數(shù)(如 茄尼醇濃度超出標準曲線線性范圍，則適當調(diào)整移取體積和定容體積)，經(jīng)濾膜 過濾，濾液待上機測定。6.9馬鈴薯葉提取物(提取液)試樣處理若樣品為馬鈴薯葉提取物(提取液)時，稱取約0.1 g (精確到O.OOOlg) 馬鈴薯葉提取物(提取液)置于10 ml燒杯中，用正己烷溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL 的棕色容量瓶中，然后用正己烷定容，搖勻。再根據(jù)上面的皂化實驗步驟進行 皂化實驗，然后測定馬鈴薯葉提取物(提取液)中的總茄尼醇含量。6.10 檢測方法6.10.1 色譜質(zhì)譜條件按照制造商操作手冊運行

34、高效液相色譜-質(zhì)譜儀(5.6)。以下分析條件可供 參考，采用其他條件應驗證其適用性：液相色譜條件：色譜柱：C 18, 150 mmX2.1 mm (內(nèi)徑)，粒徑3.5 pm,或性能相當者； 流動相：甲醇+異丙醇( 50%+50%)進樣體積： 10 pL；柱溫：35C；流速： 0.4 mL/min；洗脫時間： 8 min；質(zhì)譜條件：離子掃描模式：正離子全掃模式；母離子m/z為653.6；毛細管溫度(Capillary Temperature)： 350C；霧化溫度(Vaporizer Temperature) 300C；鞘氣壓力(Sheath Gas Pressure): 35Arb；噴霧電壓(

35、Spray Voltage): 3500V ；套管透鏡電壓(Tube lens)： 91V；6.10.2 標準曲線分別取適量的茄尼醇系列標準工作溶液0.1 pg/mL、1 yg/mL、5 yg/mL、10 yg/mL、50 pg/mL及待上機試樣溶液，按照上述列出的條件進行液相色譜-質(zhì)譜 分析測定。由保留時間和m/z對茄尼醇進行定性，根據(jù)茄尼醇標準工作溶液響 應信號，建立標準工作曲線，工作曲線線性相關(guān)系數(shù)R220.997，對試樣的茄尼 醇含量進行定量計算。待測樣液中茄尼醇的響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應 稀釋后再進行分析。分析過程中，每20次樣品測定后應加入一個與樣品峰面積 相

36、近的標準工作液，如果測得的值與原值相對平均偏差超過 5%，則應重新進行 標準曲線的制作。目標物線性方程線性范圍(卩g/mL)相關(guān)系數(shù)(R2)茄尼醇Y=-568632+815076*X0.1500.9981MCKXKMfI20OM& IlKKXKKFMCKXKMfI20OM& IlKKXKKFIWXK 冊 fiOOCKMb -100000 20OCKM2345678Time (riiiii)圖6-1標準溶液總離子流出圖7CJuUTtp urlqrt:AAHTT-UM45Tijne mln)圖 6-2 馬鈴薯葉樣品總離子流出圖01234567Time (min-式VW-匚詡 punqsV=IPH5

37、0COTO-圖 6-3 提取物 1 樣品總離子流出圖二 *ru-unps!l 上su-*=3iphTJme(nhi)圖6-4提取液2樣品總離子流出圖6.10.3 精密度和穩(wěn)定性 日內(nèi)穩(wěn)定性檢測方法為：分別以馬鈴薯葉、購買的馬鈴薯葉提取物 1、購 買的馬鈴薯葉提取液 2 為樣品，按 6.8 和 6.9 的方法對樣品進行提取分別得茄尼 醇提取液。制備好的3種茄尼醇提取溶液，用0.22 Mm微孔濾膜過濾后進行液 相色譜-質(zhì)譜分析，分別測定馬鈴薯葉、購買的馬鈴薯葉提取物 1、購買的馬鈴 薯葉提取液 2 中茄尼醇含量的日內(nèi)和日間的相對標準偏差，日內(nèi)的在每天 8 時、 10 時、12 時、14 時、16

38、時、18 時分別進行測定，最后計算相對標準偏差，結(jié) 果見表 6-1。日間的在每天固定時間 10 時連續(xù)測定 6 天，最后計算各個樣品的 相對標準偏差，結(jié)果見表6-2，由表可得，測定樣品的 RSD 值在 0.9 %5.1%之 間，說明該標準方法的精密度良好，穩(wěn)定性良好，各個樣品的精密度數(shù)據(jù)匯總 見表 6-3。表6-1各個樣品日內(nèi)的穩(wěn)定性測試結(jié)果(n=6)茄尼醇含量(mg/g)日內(nèi)次數(shù) 馬鈴薯葉馬鈴薯葉提取物 1 馬鈴薯葉提取物 2123123451.435.95x1021.87x1021.555.74x1021.85x1021.595.77x1021.86x1021.625.75x1021.86

39、x1021.485.75x1021.84x10261.445.69x1021.82x102平均1.525.77x1021.86x102RSD(%)5.11.50.9表6-2各個樣品日間的穩(wěn)定性測試結(jié)果(n=6)茄尼醇含量(mg/g)日間次數(shù)馬鈴薯葉馬鈴薯葉提取物1馬鈴薯葉提取物211.435.37x1021.98x10221.475.74x1021.82x10231.635.47x1021.88x10241.585.35x1021.99x10251.525.56x1021.94x10261.555.57x1021.78x102平均1.535.51x1021.90 x102RSD( %)4.82

40、.64.7表6-3本方法的精密度實驗研究結(jié)果(n=6)樣品名稱馬鈴薯葉馬鈴薯葉提取物1馬鈴薯葉提取液2日內(nèi)相對標準偏差()5.11.50.9日間相對標準偏差()4.82.64.76.10.4 方法的準確度實驗分別以馬鈴薯葉、購買的馬鈴薯葉提取物 1、購買的馬鈴薯葉提取液 2 為研究對象，分別進行茄尼醇的不同加標水平回收實驗，各個樣品的加標實驗 結(jié)果見表6-4，由表可得，茄尼醇樣品的回收率在80.7%109.0%之間，RSD均 6.6%，說明該標準方法的結(jié)果可靠，可以用作實驗參考的標準方法，各個樣 品茄尼醇含量的測定結(jié)果見表 6-5。表6-4各個茄尼醇樣品最終測定結(jié)果及回收率(n=6)檢測參數(shù)樣

41、品名 稱取樣量(g)茄尼醇含量(mg/g)樣品中 茄尼醇 含量(mg)添加水平(mg/g)實測茄尼醇含量(mg/g)回收率 (%)平均 回收 率(%)RSD (%)總茄尼馬鈴薯1.00001.531.531.02.5197.999.06.6馬鈴薯葉提取 0.10155.86x10259.530物1馬鈴薯葉提取 0.10061.86x10218.710液馬鈴薯葉提取 0.10155.86x10259.530物1馬鈴薯葉提取 0.10061.86x10218.710液22.4288.82.5097.12.55102.02.5299.22.62109.084.182.183.780.883.780.

42、884.683.783.780.784.182.128.396.028.497.028.799.628.598.028.598.428.497.081.798.01.41.16.10.5 方法的檢出限和定量限將對照品溶液逐步稀釋，進行液相色譜分析，計算其峰高與基線噪音高的 比,S/N=3 （S為對照品峰高,N為基線噪音高）時的對照品濃度為檢出限（LOD）, 得到茄尼醇的檢測限0.1 pg/g; S/N=10時的濃度為定量限（LOQ）,得到茄尼醇 的定量限為0.3 pg/g。6.10.6 方法驗證選擇 5 家具有資質(zhì)的實驗室參加方法的驗證工作。向驗證單位提供方法草 案、驗證方案、標準溶液和驗證報

43、告格式。驗證單位按照方法草案準備實驗用 品，在規(guī)定時間內(nèi)完成驗證實驗并反饋驗證結(jié)果報告。在方法驗證前，參加驗 證的操作人員應熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方法驗證過程中所用 的試劑和材料、儀器和設備及分析步驟應符合方法相關(guān)要求。6.10.7 小結(jié)上述結(jié)果表明，采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定馬鈴薯葉及其制品中茄尼醇的 含量，實驗室內(nèi)方法的檢出限為0.1 pg/g，定量限為0.3 pg/g。測定方法的日內(nèi)和 日間的相對標準偏差在0.9 %5.1%，對馬鈴薯葉、購買的茄尼醇提取物1、購買 的茄尼醇提取液2等實際樣品進行加標回收實驗，回收率在80.7% 109.0%之間， RSD均 6.6%，說明該標準方法的結(jié)果可靠，說明方法的精密度和準確度良好。綜上所述，本標準方法能夠滿足馬鈴薯葉及其加工制品中茄尼醇含量測定的 要求。7.采用國際標準和國外先進標準程度，以及與國際、國外同類標準水平的對比情況目前芒果苷含量測定方法無國際標準和國外先進標準可參照。本標準在制訂 過程中對以芒果葉為原料的芒果苷制品的質(zhì)量、檢測和市場進