液相色譜分析條件的選擇

1、液相色譜分析條件的選擇在液相色譜分析過(guò)程中，我們經(jīng)常遇到的問(wèn)題主要有二種，一種與液相色譜儀器本身因素有關(guān)，如液相色譜的 閥門(mén)、混合器、檢測(cè)器的光源以及其它的一些硬件設(shè)備。出現(xiàn)這類(lèi)問(wèn)題后，如果能找出問(wèn)題根源，解決起來(lái)一般很 簡(jiǎn)單，而且這類(lèi)問(wèn)題可以通過(guò)對(duì)儀器的精心維護(hù)來(lái)避免;而另一類(lèi)問(wèn)題則是分析方法本身造成的問(wèn)題，如出現(xiàn)色譜峰 形狀不好、峰與峰之間不能分開(kāi)、基線飄移等等。不幸的是，如果出現(xiàn)這類(lèi)問(wèn)題，看起來(lái)似乎很明顯，但是要找出 原因并解決這類(lèi)問(wèn)題卻非常困難。為了減少出現(xiàn)這一類(lèi)型的問(wèn)題，就必須在分析之前，仔細(xì)研究并選擇一個(gè)好的分 析方法，有了一個(gè)好的分析方法，就很容易獲得理想的分離效果，而且在出現(xiàn)問(wèn)

2、題是也很便于找出原因。要選擇一 個(gè)好的分析方法，就必須對(duì)液相色譜分析的一些基本原則要有一個(gè)很深的了解。下面是我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)色譜分析人員 進(jìn)行技能培訓(xùn)的一些基本知識(shí)。一：分析方法選擇的基本原則假如你想做一頓豐盛的晚餐，首先必須看一下食譜，然后檢查一下你所需的東西是否齊全，如果少了配料還必 須去商店購(gòu)買(mǎi)，這樣你才可能做出一頓可口的晚餐。同樣進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，也必須按照一定的程序進(jìn)行，首先 你必須要有專(zhuān)門(mén)的儀器和試劑，然后有目的地選擇分析方法，這樣你才可能得到好的分析結(jié)果，避免走一些彎路。二：柱子的選擇在液相色譜分析方法中最重要的就是色譜柱的選擇，色譜分析人員面對(duì)幾百種色譜柱，你從何入手呢?我采取的

3、 方法就是訂閱LCGC亞太版中Ron Majors的“色譜柱觀察這一專(zhuān)欄，自1984(1)年以來(lái)，Ron Majors在這一專(zhuān)欄 中介紹許多新柱子、色譜柱新技術(shù)、色譜柱使用方法等方面的信息。現(xiàn)在大部分液相色譜分析都是使用反相色譜柱，其中以C18和C8柱最為流行。然而色譜分析并不是流行歌曲， 這兩種色譜柱之所以運(yùn)用廣泛是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的 分離并不是這兩種柱子(如表一所示)，但C18和C8經(jīng)常是最好的固定相，C18和C8柱兩者之間并無(wú)明顯的差別， 但在我們實(shí)驗(yàn)室中以常使用的是C8柱。色譜分析人員遇到的多數(shù)樣品需要利用反相色譜柱進(jìn)行分析，但一些

4、樣品可能需要其它的分析技術(shù)才能成功地 分離，這些樣品及分離方法在表一中作了簡(jiǎn)要的敘述，在以后的章節(jié)中將進(jìn)一步闡述。表一：樣品及分析方法樣品的特性分析方法及色譜柱大分子量專(zhuān)用色譜柱、離子交換柱、size-excusion色譜柱手性異構(gòu)體手性色譜柱其它異構(gòu)體(位置、立方體)正相色譜柱、沒(méi)有改性的二氧化硅柱無(wú)機(jī)鹽混合物離子色譜分析碳水化合物(糖類(lèi))反相氨基柱、離子交換法在過(guò)去的15年中，高純度、低金屬雜質(zhì)含量的硅膠基質(zhì)色譜柱是最為實(shí)用的色譜柱之一。但傳統(tǒng)色譜分析用的 硅膠顆粒具有差異性及酸性表面，固定在柱子表面后，導(dǎo)致出現(xiàn)拖尾峰，而且柱與柱之間的重現(xiàn)性較差(2.3)。最近 硅膠基質(zhì)中出現(xiàn)一種新的產(chǎn)品

5、，這種硅膠具有Metal-free特性，因此柱子性能更穩(wěn)定，重現(xiàn)性也更好，分離后峰的 形狀也很不錯(cuò)。這種改性后的硅膠稱(chēng)為B型硅膠。由于具有上述優(yōu)點(diǎn)，大多數(shù)色譜制造商都用不同的名稱(chēng)來(lái)表明它 們與傳統(tǒng)的產(chǎn)品之間的不同，如Intertsil (日本)、BDS(USA)、YMC-Base(USA)等等。大多數(shù)色譜柱制造商都生產(chǎn) 以B型硅膠為基質(zhì)的色譜柱，因此你可以選擇你所喜歡的供應(yīng)商提供的產(chǎn)品。由于這種產(chǎn)品具有上述特性，建議使 用A型硅膠柱的改為使用B硅膠柱。三：柱子尺寸規(guī)格的選擇液相色譜分析時(shí)柱子選擇的另一個(gè)因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑(dp)的選擇。最常用顆粒直徑為5pm, 但顆粒的直徑(d

6、p)為3.0及3.5pm的也適合分析使用，但大多數(shù)色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5pm的色譜柱， 因?yàn)檫@種色譜柱具有很長(zhǎng)的使用歷吏。顆粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數(shù)，但所需的柱壓增大，而且 dp為3.0pm的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產(chǎn)出dp為3.5pm的色譜柱。在我們實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的是150mmx4.6mm，dp為5pm的色譜柱。另一種可以選擇的色譜柱為 75mmx4.6mm，dp為3.5pm的柱子，這種柱子的分離效果與前一種色譜柱分離效果相似，但使用時(shí)間減小一半。 這兩種柱子還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是在合理的壓力下(2000psi )，流速可以設(shè)定在1.5-2.0ml/min之

7、間，而流速高意味著 可以縮短分析時(shí)間。有些分析者建議使用30 or50mm長(zhǎng)的柱子作為前處理柱，但這種柱子不能提供足夠的塔板數(shù)。另一種意見(jiàn)是使 用窄孔柱(2mmid)或微孔柱(1mmid)，這兩種柱子所需的溶劑少，但是這兩種柱子所需的某些儀器與正常使用的色譜 儀有些不同，而且正處在一個(gè)研究階段，建議等這兩種色譜柱研究成熟之后再使用。150mmx4.6mm，dp為5pm的色譜柱最為常用，75mmx4.6mm，dp為3.5pm的色譜柱也中較常見(jiàn)，在一般情 況下流速可設(shè)定為1.5ml/min。四：有機(jī)相的選擇獲得成功分離的另一個(gè)重要因素就是流動(dòng)相有機(jī)溶劑的選擇，如果使用反相色譜柱可以有三種有機(jī)溶劑可

8、以選 擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，但色譜分析人員很少能預(yù)見(jiàn)哪一種溶劑更合適，所以 具體選擇哪一種溶劑你必須充分考慮同行的意見(jiàn)。在我的實(shí)驗(yàn)室中多數(shù)工作分析藥物中的成份，其中有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時(shí)紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)為 220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強(qiáng)，所以在波長(zhǎng)低于240nm時(shí)，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度 的甲醇在較低的波長(zhǎng)下也可使用，但是在低于220nm時(shí)，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品 及空氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過(guò)氧化物，所以使用這種溶劑時(shí)須格外小心。一些研究人員發(fā)現(xiàn)， 在四氫呋喃中加入水可以解決這個(gè)

9、問(wèn)題(4)，但它與色譜柱平衡所需的時(shí)間比甲醇、乙腈長(zhǎng)，而且其不愉快的氣味也 是一個(gè)不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的最大優(yōu)點(diǎn)是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間。考慮到理想溶劑的特點(diǎn)，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以首選的有機(jī)溶劑應(yīng) 是乙腈，當(dāng)然利用甲醇作為有機(jī)溶劑的也較為常見(jiàn)。五：水相的選擇假如樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時(shí)普遍存在，而這類(lèi)化合物需要控制 PH值才能得到很好的分離。如流動(dòng)相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個(gè)單位。在分析有機(jī)酸時(shí)，當(dāng)PH值 低于3時(shí)，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當(dāng)PH值高于8

10、時(shí)，就需要緩沖液，因?yàn)榇薖H值已經(jīng)超出了二氧化硅的 有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見(jiàn)，但是對(duì)高PH值物質(zhì)的分離，很少有這方面的報(bào)道。所以建議使 用緩沖液來(lái)減少二氧化硅的流失。考慮到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析 PH值較高的物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 (PH=2.5)是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選擇易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的 緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿(mǎn)足PH值的控制要求。六：其它的因素在你選擇液相色譜的分析方法時(shí)，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因?yàn)闇囟茸兓?度，保留時(shí)間將變 化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性，這會(huì)使你更積極地投入到溫度選擇中去。在 分析時(shí)柱溫一般比室溫高一點(diǎn)(如35C)，因?yàn)榇藴匾卓刂?，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓?有時(shí)你需要利用其它的一些方法，如在流動(dòng)相中加入部分特殊的物質(zhì)，不過(guò)我建議最好在你實(shí)在必須時(shí)才用這種方 法，記住KISS原則(Keep it simple ，stupid)，不要