生命科學超微量樣本檢測和紫外檢測技術-13.12.21

1、生命科學超微量樣本檢測和紫外檢測技術 基因 市場部 熊雪主要內(nèi)容一、分光光度計檢測原理二、超微量分光光度計NanoDrop三、NanoDrop家族一、分光光度計檢測原理A:吸光度K:摩爾消光系數(shù)( Lmol-1cm-1)L:光路徑cmC:物質(zhì)濃度mol/L比爾-朗伯定律C=A/KL核酸的檢測 260法核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收的特性，最大吸收波長在250-270nm之間，形成核酸后期最大的吸收波長在260nm，吸收波谷在230nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：10OD260nm相當于50g/ml dsDNA、

2、 37g/ml ssDNA、 40g/ml RNA、30g/ml單鏈寡聚核苷酸蛋白的檢測UV法280法比色法: Lowry Bradford BCAUV method純化的蛋白蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結構，在紫外280nm波長處有最大吸收峰簡便，蛋白結構無破壞但是，不同的蛋白質(zhì)具有不同的消光系數(shù)；核酸可引起強烈干擾ExPASy蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫消光系數(shù)查找方式比色法所有蛋白顯色原理 試劑與蛋白質(zhì)的肽鍵或其他基團反響，在特定波長下形成最高吸收峰。優(yōu)點：受核酸等雜質(zhì)的影響較小受氨基酸種類和數(shù)量的影響較小核酸、蛋白精確定量熒光法原理：熒光染料與核酸/蛋白特異結合，而不與其他雜質(zhì)

3、結合。提高了檢測的靈敏度和準確性傳統(tǒng)分光光度計清水清洗樣品潤洗1-2min二、 NanoDrop分光光度計上樣檢測擦拭10s上樣量最低為0.5ul節(jié)約珍貴的樣本 全光譜掃描應用更廣泛動態(tài)范圍是10mm比色杯檢測的200倍2ng-15000ng/ul dsDNA 專利技術專利液體外表張力技術的基座石英光纖高度拋光不銹鋼套封馬達基座，可自動調(diào)整光程應用核酸檢測 260/280 260/230蛋白檢測Microarray/Protein labels檢測菌液檢測全光譜掃描自定義方法1、核酸檢測 樣品類型寡核苷酸核酸檢測結果 核酸濃度A260吸收值A280吸收值260/280比值 約為1.8(DNA)

4、或者2.0(RNA) A260/230比值 約為 2、蛋白檢測-UV法樣品類型摩爾消光系數(shù)質(zhì)量消光系數(shù)實例2摩爾消光系數(shù)實例3質(zhì)量消光系數(shù)蛋白檢測結果蛋白濃度A280吸收值A260/280比值 約為0.53、蛋白檢測-比色法以BCA方法為例，檢測蛋白濃度dsDNA檢測時，最常用的染料為PicoGreen dye ，PicoGreen dye是一種新型的dsDNA染料：其檢測靈敏度高，可檢測到pg級DNA；檢測范圍寬，可跨越4個數(shù)量級；特異性好，根本不受ssDNA和RNA的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白等干擾。并被2021年版?中華人民共和國藥典?選為藥物殘留DN

5、A定量方法4、熒光法以Picro Green方法為例，檢測dsDNA濃度5、菌液OD檢測 OD600OD600 應用：在誘導細菌蛋白表達時，可監(jiān)視細菌生長的過程在制作感受態(tài)細菌時，可判斷細菌生長的最正確時期在檢測時，會形成光散射當光穿過樣品到達檢測器時，局部光會損失，因為樣品能吸收局部光在細菌懸液中，由于產(chǎn)生了光散射，穿過菌液到達檢測器的光減少了，從而會導致樣品OD值增大的假象。監(jiān)測細菌的生長, OD600在不同儀器上檢測OD600的結果：OD600的檢測受到兩大因素影響：儀器的光學部件；檢測的樣品類型ND的比色皿模塊和基座都可以進行菌液檢測：用ND檢測菌液的優(yōu)勢NanoDrop2000c基座

6、檢測菌液時應注意：基座檢測時，最大的光程為1mm，注意將得到的OD值乘10，以便得到10mm下的OD值進行后續(xù)分析?；鶛z測時，應充分混勻，并取2mL菌液進行檢測新應用拓展一、Microarray/Protein&labels二、檢測細胞的死活率三、對染料工業(yè)產(chǎn)品進行質(zhì)控四、納米粒子定量一、在DNA Microarrays中的質(zhì)控純化的RNA純化的 DNAcDNA參加熒光染料雜交數(shù)據(jù)分析Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y在Protein Arrays中的質(zhì)控純化的蛋白或細胞裂解液雜交數(shù)據(jù)分析參加標記蛋白或熒光二抗Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YY Y

7、 Y Y Y YMicroarray/Protein labels 檢測在Microarray/Protein labels實驗中，對核酸/蛋白與染料的結合效率質(zhì)檢染料編輯細節(jié)FOI標記效率FOI(Frequency Of Incorporation)Cy3標記RNA的FOI=(OD550/0.15)*(324)/(OD260*40)Cy5標記RNA的FOI=(OD650/0.25)*(324)/(OD260*40)FOI20時,說明染料雜交效率高，染料十分匹配；20FOI15時,說明染料雜交比推薦值低，但勉強可以用；FOI20 可用Cy5標記RNA的FOI=(OD650/0.25)*(324

8、)/(OD260*40) =(0.002/0.25) *324/(0.119*40) =0.54415 不建議使用二、用ND檢測細胞死活率P. Michel et al ; NanoDrop based method for the rapid determination of viability decline in suspension cultures of animal cells, Analytical Biochemistry 430 (2021) 138-140傳統(tǒng)檢測細胞的死活率是用臺盼藍染色法而隨著細胞的死亡數(shù)量增加，細胞破裂后釋放出的游離蛋白也會增加，所以，我們通過用A28

9、0檢測游離蛋白的含量來檢測細胞的死活率。用ND檢測細胞死活率的優(yōu)勢應用：細胞培養(yǎng)、誘導細胞蛋白表達等傳統(tǒng)的檢測細胞的死活率是用臺盼藍染色法，但要用試劑染色，要在顯微鏡下計數(shù)，非常麻煩。通過用A280檢測游離蛋白的含量來檢測細胞的死活率；無需任何試劑，減少實驗誤差。舉例：熒光素鈉做為著色劑應用于軍事、醫(yī)療和化裝品等行業(yè)；三、對染料工業(yè)產(chǎn)品進行質(zhì)控染料出廠時，對染料的濃度進行質(zhì)控，這對于確保著色的重復性有非常重要的意義！用ND，在490nm處檢測熒光素鈉的濃度用ND進行染料質(zhì)控的優(yōu)勢濃度跨度1000倍的樣品，仍能形成非常好的線性關系ND非常廣的動態(tài)范圍，可以保證高濃度和低濃度的樣品都能精確檢測無需

10、稀釋防止誤差；不銹鋼的基座耐腐蝕；重復性非常好四、納米粒子定量納米粒子大小為1-100nm納米金粒子NP的SPR分析直徑為13nm，最大吸收峰為520nm；利用520nm處的OD值來進行NP濃度的測定；在很廣的濃度范圍里，線性都非常好；消光系數(shù)即斜率為3X1010 M-1cm-1 ，與文獻報道中的一致。用ND進行納米粒子定量的優(yōu)勢應用：納米疏水藥物研發(fā)、腫瘤化療納米藥物研發(fā)、納米材料研究等1、超微量的上樣量：節(jié)約珍貴的樣品納米材料通常不易獲得且本錢非常高，所以超微量的上樣可以節(jié)約一大筆的經(jīng)費；2、非常廣的濃度檢測范圍能在很廣的濃度范圍里，得到很好的線性來計算消化系數(shù)。三、NanoDrop家族N

11、D2000 ND2000c ND Lite ND8000 ND3300 ND2000根底型Less：更微量專利的液體外表張力技術，僅需0.5l的樣本更簡單大多數(shù)樣本無需稀釋，直接上樣更快速不到五秒鐘即可得到完美的檢測結果 More：更寬190-840nm，可以測定低波長下的蛋白光吸收，如多肽的205nm光吸收更高檢測上限高達15,000 ng/l (dsDNA)更靈活-提供多種檢測模式更新-軟件提供多種檢測方式，且接受用戶自定義的檢測ND 2000c全能型懸浮細胞/細菌培養(yǎng)檢測范圍：0.4-750 ng/ldsDNA控溫精確：37 0.5攪拌速度：150 - 850 rpmFeatureBen

12、efit比色皿檢測1臺既可用于微量樣品檢測又可用于傳統(tǒng)的光譜檢測的分光光度計比色皿進行細胞培養(yǎng)測定節(jié)省金錢和實驗室空間 無需另購儀器（分光光度計或細胞密度計進行微生物細胞培養(yǎng)檢測動力學測定（具有溫控功能）用于酶動力學和生長曲線測定基座檢測+比色皿檢測ND 8000高通量型顯示多達8個樣本的全波長數(shù)據(jù)220-750nm核酸濃度和純度測定2.5-3700ng/L, dsDNA)蛋白濃度和純度測定0.15-100 mg/mL，BSA上樣托架LED指示燈用戶自定義檢測方法NanoDrop Lite精巧型小巧精干：260nm、280nm 檢測核酸的濃度和純度，蛋白的濃度無需電腦標簽打印機可選標簽打印機特

13、殊低溫打印標簽兼容實驗室有機溶劑-196到70穩(wěn)定打印關鍵樣本信息大標簽用于樣品管或記錄本中小標簽用于樣品管蓋ND 3300 熒光分光光度計1.上樣量1L，節(jié)約珍貴的樣本2.三組高性能LED UV: 365 nm Blue: 470 nm White 460-650 nm3.覆蓋400-750nm光譜，無需更換濾光片4.預置檢測方法自定義檢測條件5.無需校正維護注意：它不適合做光譜掃描Other Samples其他 4-Methyl UmbelliferoneCy3/Alexa555Cy5/Alexa647Fluorescein-FITC-FAMQuinine SulfateDylights- 405,488,549,633,649, 680Nucleic Acid 核酸PicoGreen assay dsDNARiboGreen assa