黃曲霉毒素檢測

1、黃曲霉毒素檢測第1頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五 黃曲霉毒素(aflatoxin，簡稱為AF)是到目前為止發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素。 它可通過多種途徑污染食品和飼料，直接或間接進入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全，對人體及動物內(nèi)臟器官尤其是肝臟損害嚴重，該毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中。黃曲霉毒素十分耐熱，加熱至230才能被完全破壞，因此一般烹飪加工也不易消除。黃曲霉毒素介紹第2頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五黃曲霉毒素分布范圍廣 黃曲霉毒素存在于土壤、動植物、各種堅果（特別是花生和核桃中）中。日

2、常檢驗發(fā)現(xiàn)在大豆、谷物、玉米、通心粉、調(diào)味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素（其中以花生和玉米污染最嚴重）。第3頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五毒性極強 黃曲霉毒素進入人體后主要經(jīng)消化道吸收，大部分分布 在肝臟、腎臟。因此主要引發(fā)肝癌、胃癌等，還可以誘發(fā)骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。黃曲霉毒素如不連續(xù)攝入，一般不在體內(nèi)積蓄。一次攝入后約1周將大部分排出。只有嚴重霉變的糧食才可能會含有大量毒素，導致急性毒性。第4頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五耐熱性強 在一般的烹調(diào)加工溫度下，黃曲霉毒素被破壞的很少；即使是 200高溫加熱

3、，也不能完全正確破壞。一般黃曲霉毒素的裂解溫度為280，黃曲霉毒素 B1 的裂解溫度為 268。第5頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五 黃曲霉毒素的種類 迄今為止發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素主要有4種：即B1、B2、C1、G2，其中B1被認為是主要的有毒物質(zhì)，有2種這些毒素的代謝產(chǎn)物M1和M2。 其中黃曲霉毒素B1主要存在于農(nóng)產(chǎn)品，動物飼料，中藥等產(chǎn)品中；黃曲霉毒素M1是動物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，一部分從尿和乳汁排出，一部分存在于動物的可食部分，如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中，其中以乳最為常見。 黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1的基本相似。由于牛乳

4、及其制品是人類、特別是嬰兒的主要食品，所以其危害性更大。 第6頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五中國食品中黃曲霉毒素的限量標準標準食品種類最大限量GB2761-81玉米、花生仁、花生油20g/kg大米、其他食用油10g/kg其他糧食豆類、發(fā)酵食品5g/kg嬰兒代乳食品不得檢出GB9676-88牛乳及其制品0.5g/kg第7頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五免疫分析法儀器分析法化學分析法生物鑒定法檢測方法第8頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五黃曲霉毒素的檢測方法目前，測定食品中的黃曲霉毒素的方法有：薄層層析法、液相色譜法、放射免疫

5、分析法、酶聯(lián)免疫法、親和層析法、微柱篩選法、金標試紙法等。這些方法或多或少都具有如下不足之處：（1）、在操作過程中，需要使用劇毒的黃曲霉毒素M1作為標定標準物，對操作人員造成巨大的沾污危險，而且黃曲霉毒素M1標準物質(zhì)購買十分困難。（2）、操作過程煩瑣、復雜、時間長，勞動強度大。（3）、儀器設(shè)備昂貴、笨重、操作復雜，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速分析。（4）、靈敏度較差，重復性很難得到滿意結(jié)果。第9頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五薄層色譜法（TLC）其原理是:樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后,在365 nm波長的紫外光照射下,黃曲霉毒素B1、B2產(chǎn)生紫色熒光,G1、G2產(chǎn)生綠色熒光,然后根

6、據(jù)其在薄層板上顯示的熒光的最低檢出量來定量。優(yōu)點是:所用的試劑、設(shè)備簡單,費用低廉,容易掌握,適用大量樣品的分離、篩選,一般的實驗室均可開展,屬于定性和半定量的功能。第10頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五高效液相色譜法(HPLC) 以C18柱為固定相,以水+異丙醇+乙腈(80 +12+8)為流動相,用熒光檢測器進行檢測,其激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長450 nm,以保留時間定性，峰面積定量，這些基本參數(shù)大致相同，但在流動相的選用上卻差異較大。樣品用甲醇和水混合液進行萃取,隨后進行衍生化處理,處理后溶解于流動相,進行液相色譜測定。 第11頁，共19頁，2022年，5月2

7、0日，1點44分，星期五酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是抗原(抗體)吸附劑和用酶標記的抗體(抗原)與標本中的待測物(抗原和抗體)起特異的免疫學反應，用測定酶活力的方法來增加測定的敏感度。大致采用兩種方式檢測黃曲霉毒素，一種是用雙抗體夾心法，另一種是用競爭法。第12頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五微柱法 測定黃曲霉毒素，是利用微柱管內(nèi)的硅鎂型吸附劑吸附黃曲霉毒素并在365nm紫外光下顯示熒光，其強度與一定濃度的黃曲霉毒素含量成正比關(guān)系，由此可簡略定量黃曲霉毒素。第13頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五金標試紙法 金標試紙法是利用單克隆抗體而設(shè)計的固相免

8、疫分析法,可一步式檢測AFT。一步式AFT快速檢測紙法可在510 min完成對樣品中AFB1的定性測定,具有簡單、快速、靈敏度高等特點,無須儀器設(shè)備配合測定,檢測既可在實驗室中進行,也可在農(nóng)場、飼料混合車間等進行實地測定,對黃曲霉毒素定性檢測準確度在85 %以上,靈敏度為4 ng/mL ,可測出樣品中20 ng/g的黃曲霉毒素10。Sun Xiu lan等合成一種對AFB1具有特異性的抗體金標探針,該納米金標探針用于免疫色譜法對AFB1分析,完成一個樣品分析所需要的時間少于10 min,比ELISA少610 min,在標準品的對照下,最低檢測限可達2.5ng/mL第14頁，共19頁，2022年

9、，5月20日，1點44分，星期五生物鑒定法 利用 AFT 能影響微生物、水生動物及家禽等生物體的細胞代謝, 來鑒定 AFT 的存在, 其特點是待檢樣品不需很純, 主要用于定性鑒定, 包括: 抑菌試驗; 對微生物遺傳因子影響試驗; 細菌發(fā)光試驗; 熒光反應; 組織培養(yǎng)檢測法; 雞胚試驗; 鴨胚試驗; 鱒魚試驗; 植物試驗; 飼喂實驗動物試驗。這些方法專一性差, 靈敏度低, 一般只作為化學分析法的佐證。第15頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五衍生方法 可分為柱前衍生法和柱后衍生法。對黃曲霉毒素衍生的目的主要是為了增加測定時的熒光強度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀鹽酸法，柱后衍

10、生法主要有溴法和碘法。柱后衍生需增加泵、校后反應器和控溫箱等裝量。在實踐中以柱前衍生較多，因柱前衍生法容易推廣，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分別用氮氣或直接吹氣揮干。第16頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五最新國標方法“免疫親和柱法”較好的解決了上面的不足，該種方法可以采用配套的熒光儀進行檢測，也可以和高效液相色譜法結(jié)合，解決標準物污染和操作過程繁復等問題。同時該種方法有著較好的權(quán)威性和通用性，且為國外多個組織認可，被列為標準方法，如：美國公職分析化學家協(xié)會（AOAC）美國農(nóng)業(yè)部聯(lián)邦谷物檢測中心（FGIS）國際純粹與應用化學協(xié)會（IUPAC）美國食品藥品行政署（U

11、S-FDA）美國農(nóng)業(yè)部（USDA）同時在國內(nèi)被認證的機構(gòu)：中國出入境檢驗檢疫局（CIQ）、中華人民共和國國家標準（GB）第17頁，共19頁，2022年，5月20日，1點44分，星期五 為了開發(fā)一種簡單、快速、靈敏、準確的分析方法,美國VICAM(維康)公司與哈佛大學、麻省理工學院、約翰霍普金斯大學、AOAC、FDA、FGIS、美國農(nóng)業(yè)部等著名大學和政府機構(gòu)通力合作，發(fā)明研制了一系列以單克隆免疫親和柱為分離手段，用熒光計、紫外燈作為檢測工具的分析方法。該項技術(shù)有一下特點： 1、認證機構(gòu)廣泛，通用性強2、分析速度快，一個樣品只需1015分鐘，其他傳統(tǒng)的方法要做到定量分析需要幾小時至幾天的時間。3、靈敏度高，測定范圍廣泛（0300ppb）,用熒光計可以測定0.1ppb的黃曲霉毒素M1，用HPLC可以檢測出10ppt的黃曲霉毒素M1。4、采用單克隆免疫技術(shù)，可以特效性地將黃曲霉毒素和其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高，正確性和可靠性強。5、儀器輕便容易攜帶，自動化程度高，操作簡單，直接讀出測試結(jié)果，對實驗操作人員要求不高，可以在小型實驗場所使用。6、不需要劇毒的黃曲霉毒素和其他真菌毒素標準物來標定，所以在整個實驗過程中，絕對安全可靠。免疫親和柱法(IAC-AFLATEST)第18頁，共19