健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

1、安康人APOBEC3G基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定【摘要】目的克隆人載脂蛋白BRNA編輯酶催化多肽樣3G(aplipprtEinBRNAeditingenzye，atalytiplypeptide3G，APBE3G)基因DNA，構(gòu)建APBE3G基因的真核表達(dá)載體，并在體外進(jìn)展表達(dá)和鑒定。方法采用RT-PR技術(shù)從安康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆APBE3G基因，將該基因插入pDNA3.1真核表達(dá)載體，構(gòu)建pDNA3.1-A3G真核表達(dá)質(zhì)粒，并利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pDNA3.1-A3G轉(zhuǎn)染HepG2和HL7702細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、esternblt等方法檢測APBE3G真核表達(dá)情況。結(jié)果雙

2、酶切鑒定和測序結(jié)果說明，APBE3G真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。免疫細(xì)胞化學(xué)和esternblt結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)染pDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702細(xì)胞APBE3G蛋白均高表達(dá)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的HepG2和HL7702細(xì)胞APBE3G蛋白低表達(dá)或不表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了人載脂蛋白BRNA編輯酶催化多肽樣3G真核表達(dá)載體pDNA3.1-A3G，為進(jìn)一步研究APBE3G抗HBV作用奠定實(shí)驗(yàn)基?！娟P(guān)鍵詞】APBE3G;克隆;真核表達(dá)載體Abstrat：bjetiveTlnetheDNAfhuanaplipprtEInBRNAeditingenzye,atalytiplypept

3、ide-like3G(APBE3G)geneandnstruttheeukarytiexpressinvetrfrtheinvitrexpressinandidentifiatin.ethdsThedingreginfAPBE3GgeneasaplifiedbyRT-PRfrperipheralbldnnulearells(PBs)fhealthyhuans,andthenthegenefragentasinsertedinttherebinanteukarytiexpressinvetrpDNA3.1tnstruttheeukarytiexpressinplasidfpDNA3.1-A3G,

4、hihastransfetedintHepG2andHL7702ells,respetively.TheexpressedprdutsintheHepG2andHL7702ellseredetetedbyiunytheistryandesternblt.ResultsTheresultsfdubleenzyedigestinandsequeningshedthatthepDNA3.1-A3G-transfetedHepG2andHL7702ellserebthhighlyexpressed,hiletheellstransfetediththeblankplasidpDNA3.1andthse

5、untransfetedellserelexpressedrunexpressed.nlusinTheeukarytiexpressinvetrfhuanAPBE3G,i.e.,pDNA3.1-A3Gassuessfullynstruted,hihlaysanexperientalbasisfrthestudyfAPBE3GagainstHBV.Keyrds：APBE3G;lne;eukarytiexpressinvetr人載脂蛋白BRNA編輯酶催化多肽樣3G(APBE3G)1是在研究HIV時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種RNA/DNA編輯酶，具有胞嘧啶脫氨酶活性，可使胞嘧啶()脫氨基變?yōu)槟蜞奏?U)，從而誘導(dǎo)病

6、毒基因組發(fā)生堿基突變。其可抑制病毒感染因子(virininfetivityfatr，vif)缺陷性(vif)HIV-1在非允許細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、Hut68和人T淋巴瘤細(xì)胞系E等)內(nèi)的復(fù)制，成為近年來逆轉(zhuǎn)錄病毒研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大進(jìn)展。HBV雖不屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但其有一個(gè)與HIV類似的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程。有研究說明APBE3G可抑制HBV復(fù)制2-3，但詳細(xì)機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)從安康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆APBE3G基因，并構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究APBE3G抑制HBV復(fù)制的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基矗1材料和方法1.1材料1.1.1質(zhì)粒、細(xì)胞株pDNA3.1質(zhì)粒、HepG2細(xì)胞和HL7702細(xì)胞由

7、本室保存。1.1.2主要試劑及引物RPI-1640培養(yǎng)粉、Lipfetaine2000(Invitrgen公司)，PR試劑盒(Prega公司)，限制性內(nèi)切酶Hind、ER(Takara公司)，兔抗人APBE3G多克隆抗體(AVIVA公司)，PR引物及測序由上海生工生物工程技術(shù)效勞完成。1.1.3儀器2恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、PR擴(kuò)增儀、Biphteter生物分光光度計(jì)(Eppendrf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BI-RAD公司)。1.2方法1.2.1APBE3G的克壟真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定抽取安康人外周血，別離搜集單個(gè)核細(xì)胞(PBs)，Trizl法提取RNA。RT-PR擴(kuò)增獲得約1.2kb大小

8、的含APBE3G全基因編碼序列的DNA片段。逆轉(zhuǎn)錄反響體系為25l，混勻后置42孵育1h。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2l為模板進(jìn)展PR擴(kuò)增。上游引物序列：5-AAGTTATGAAGTATTAGAAA-3，下游引物序列：5-GGAATTTAGTTTTTGATTTGGAG-3。上、下游引物序列5端分別帶有Hind和ER酶切位點(diǎn)。PR循環(huán)參數(shù)：955in預(yù)變性;隨后951in，551in，722in，共35個(gè)循環(huán);最后72延伸10in。PR產(chǎn)物純化后用Hind和ER酶切、回收并連接到pDNA3.1載體上，轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、挑選并經(jīng)酶切鑒定，獲得APBE3G真核表達(dá)質(zhì)粒pDNA3.1-A3G，并經(jīng)測序確證。1.2.2RT

9、-PR鑒定APBE3G的真核表達(dá)人肝癌細(xì)胞HepG2用含10%小牛血清、100U/l青霉素、100g/l鏈霉素的RPI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。人正常肝細(xì)胞HL7702用含20%小牛血清,其他成分同HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種6孔板后，用Lipfetain2000分別將質(zhì)粒pDNA3.1、pDNA3.1-A3G轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做空白對照，同法轉(zhuǎn)染HL7702細(xì)胞，操作按試劑說明書進(jìn)展。轉(zhuǎn)染72h后搜集細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)展RT-PR。1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定APBE3G的真核表達(dá)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，接種24孔板后，轉(zhuǎn)染方法同上，操作按試劑說明書進(jìn)展。轉(zhuǎn)染72h后，PBS洗滌細(xì)

10、胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞質(zhì)中目的蛋白：經(jīng)4%多聚甲醛固定和0.1%TritnX-100通透細(xì)胞膜后，依次參加一抗和二抗，加NBT/BIP顯色液顯色后于光鏡下觀察,并照相。1.2.4esternblt鑒定APBE3G真核表達(dá)細(xì)胞常規(guī)在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染方法同上，操作按試劑說明書進(jìn)展。轉(zhuǎn)染72h后搜集細(xì)胞蛋白，進(jìn)展SDS電泳和蛋白印跡分析鑒定。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1RT-PR擴(kuò)增APBE3GDNA從外周血單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果(圖1)可以看出，在約1.2kb處有一明顯條帶，與預(yù)期的APBE3G基因片段相符。圖1RT-PR擴(kuò)增人APBE3

11、GDNA:DNALadder;1,2:RT-PR擴(kuò)增產(chǎn)物2.2真核表達(dá)載體pDNA3.1-A3G的構(gòu)建與鑒定將上述PR回收產(chǎn)物用Hind和ER限制性內(nèi)切酶消化后與用同樣酶切的線狀載體pDNA3.1相連,使之插入到多克隆位點(diǎn)Hind和ER之間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pDNA3.1-A3G。重組質(zhì)粒pDNA3.1-A3G酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2。圖2重組質(zhì)粒pDNA3.1-A3G的酶切鑒定:DNALadder;1:pDNA3.1-A3G/Hind+ER;2:pDNA3.1-A3G可以看出，將重組質(zhì)粒pDNA3.1-A3G用Hind和ER雙酶切后，得到大小約1.2kb的片段，大小與理論值相符，說明目的片段

12、被連接到載體中。為進(jìn)一步確認(rèn)，對重組質(zhì)粒pDNA3.1-A3G進(jìn)展了DNA序列測定，測序結(jié)果證實(shí)APBE3G基因序列與GenBank公布一致。2.3重組質(zhì)粒pDNA3.1-A3G轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的鑒定2.3.1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中A3GRNA的RT-PR結(jié)果RT-PR結(jié)果(圖3)可以看到，轉(zhuǎn)染pDNA3.1-A3G的HepG2細(xì)胞較轉(zhuǎn)染pDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞目的基因條帶亮，提示在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中，APBE3G基因高表達(dá)。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HL7702細(xì)胞亦可見目的基因表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見目的條帶表達(dá)，說明重組質(zhì)粒在HL7702細(xì)胞中獲得表達(dá)。圖3RT-

13、PR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞A3GRNA表達(dá)A.HepG2細(xì)胞RT-PR后跑瓊脂糖凝膠電泳示A3GRNA表達(dá)(:DNALadder,1:轉(zhuǎn)pDNA3.1-A3G,2:轉(zhuǎn)pDNA3.1,3:未轉(zhuǎn)染);B.HL7702細(xì)胞A3GRNA表達(dá)(:arker,1:轉(zhuǎn)pDNA3.1-A3G,2:轉(zhuǎn)pDNA3.1,3:未轉(zhuǎn)染);-atin為內(nèi)參2.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定為進(jìn)一步直觀分析目的分子的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pDNA3.1細(xì)胞為陰性對照，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照進(jìn)展免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，結(jié)果顯示(圖4)，轉(zhuǎn)染pDNA3.1-A3G的細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pDNA3.1的細(xì)胞染色深，提示蛋白表達(dá)量前者較后二者增

14、高。圖4HepG2和HL7702細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)(200)A、B、示HepG2細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果(A:未轉(zhuǎn)染,B:轉(zhuǎn)pDNA3.1,:轉(zhuǎn)pDNA3.1-A3G);D、E、F示HL7702細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果(D:未轉(zhuǎn)染,E:轉(zhuǎn)pDNA3.1,F:轉(zhuǎn)pDNA3.1-A3G)2.3.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的esternblt結(jié)果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，提取蛋白進(jìn)展esternblt檢測，結(jié)果說明(圖5)，轉(zhuǎn)染pDNA3.1-A3G的HepG2細(xì)胞較轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞目的蛋白高表達(dá);轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HL7702細(xì)胞有目的蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的HL7702細(xì)胞未見目的蛋白表達(dá)。此結(jié)果

15、與RT-PR結(jié)果相符。3討論人類APBE3G基因位于人的第22號染色體長臂(22q13.1-q13.2)上，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，DNA長度為1155bp，編碼384個(gè)氨基酸，是載脂蛋白BRNA編輯酶催化多肽(APBE)家族的一員，主要在人外周血單個(gè)核細(xì)胞、脾細(xì)胞、卵巢和睪丸等細(xì)胞或組織表達(dá)。已有大量的研究結(jié)果說明，APBE3G能顯著抑制HIV的復(fù)制4-5。目前慢性乙型肝炎的治療藥物主要是干擾素和核苷類似物，但由于治療副作用和病毒耐藥等原因，治療效果不理想。因此尋找新的抗病毒藥物勢在必行。HBV有一個(gè)與HIV相似的逆轉(zhuǎn)錄過程，據(jù)此推測APBE3G可以抑制HBV的復(fù)制。2022年，Ture

16、lli等2在?Siene?上發(fā)表文章首次證實(shí)了APBE3G對HBV具有強(qiáng)烈抑制作用。大量研究證實(shí)了APBE3G對HBV的抑制作用6，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究目的在于克隆APBE3G的DNA及構(gòu)建APBE3GDNA真核表達(dá)載體，為研究APBE3G抑制HBV的機(jī)制提供基因來源和技術(shù)手段。因此根據(jù)GenBank中APBE3GDNA序列設(shè)計(jì)了上下游引物，進(jìn)展RT-PR,并成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pDNA3.1-A3G，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和HL7702細(xì)胞，經(jīng)RT-PR、免疫細(xì)胞化學(xué)和esternblt分析鑒定，此蛋白表達(dá)載體可在真核細(xì)胞中表達(dá)，為下一步應(yīng)用該載體探究APBE3G蛋白對HBV抑制作

17、用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1SheehyA,GaddisN,hiJD,etal.IslatinfahuangenethatinhibitsHIV-1infetinandissuppressedbytheviralVifprtEinJ.Nature,2002,418(6898):646-650.2TurelliP,angeatB,TstS,etal.InhibitinfhepatitisBvirusrepliatinbyAPBE3GJ.Siene,2022,303(5665):1829.3NguyenDH,GuuluruS,HuJ.Deainatin-independentinhibitinfhepatitisBvirusreversetransriptinbyAPBE3GJ.JVirl,2022,81(9):4465-4472.4RseK,arin,KzakSL,etal.TransriptinalregulatinfAPBE3G,aytidinedeainasethathyperutateshuaniundefiienyvirusJ.JBilhe,2