中藥復方對2型糖尿病大鼠的胰腺中Bcl2、Bax表達的影響

1、中藥復方對2型糖尿病大鼠的胰腺中Bcl-2、Bax表達的影響【摘要】目的研究中藥復方本草消渴丹對糖尿病模型大鼠胰腺組織凋亡相關基因Bl-2和Bax表達的影響，討論復方中藥治療糖尿病的作用機理，為臨床用藥提供科學根據(jù)。方法將32只istar大鼠隨機分為正常對照組8只，造模組24只。造模組給予高糖、高脂飼料3周后，一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素STZ，25g/kg，繼續(xù)予高糖、高脂飼料4周，造模成功后，隨機分為糖尿病模型組、復方中藥治療組和陽性藥物對照組，分別給予生理鹽水、本草消渴丹和二甲雙胍片灌胃4周，每周末斷尾取血檢測空腹血糖值。治療4周后檢測各組大鼠血糖變化，用RT-PR檢測胰腺凋亡相關基因

2、Bl-2和Bax的表達變化。結果中藥復方治療組糖尿病大鼠的體質量增長明顯比模型對照組快，血糖程度、血糖曲線下面積均低于模型對照組，凋亡相關基因Bl-2的表達升高，而Bax表達降低。結論本草消渴丹治療糖尿病的機制之一是通過抑制胰腺細胞的凋亡來實現(xiàn)的。【關鍵詞】中藥復方；糖尿病；凋亡；Bl-2；Bax；胰腺糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝障礙性疾病，其發(fā)病率有逐年上升趨勢，其特征性表現(xiàn)為高血糖和糖尿。西醫(yī)方面雖有多種治療方法和藥物，但由于西藥的毒副作用，使西藥在糖尿病的治療方面未能獲得打破性進展。近年來，中醫(yī)藥在防治糖尿病方面表現(xiàn)出宏大的潛力，無論是單味中藥還是中藥復方，在治療糖尿病方面均顯示出很

3、大優(yōu)勢1,2。本實驗以驗方生地、山藥、枸杞和山萸肉為根底經(jīng)提取制本錢草消渴丹，通過干預2型糖尿病大鼠模型，觀察其對2型糖尿病大鼠血糖和胰腺凋亡相關基因Bl-2和Bax的表達的影響，為臨床用藥提供科學根據(jù)。1材料與儀器1.1藥物將復方中藥主要成分：生地20g，山藥20g，枸杞子10g，山萸肉15g分別用醇提水沉法提娶濃縮、枯燥、制成顆粒劑，每克顆粒劑相當于原藥材9.2g，由河北大學醫(yī)學部藥劑教研室提供，以上藥材購自保定市中藥飲片。鹽酸二甲雙胍片，規(guī)格每片0.25g，由天津太平洋制藥提供，批號071204；鏈脲佐菌素STZ由美國Siga提供，批號S-0130；TRI-ZL和RT-PR藥盒等購自GI

4、B-BRL公司,100bpDNA梯度標記物為PREGA公司產(chǎn)品。其他試劑均為市售產(chǎn)品。1.2儀器AR1530電子分析天平(1/1000，美國奧豪斯)；GT-1640京都血糖儀SUPERGLUARD及試紙(由日本ARKRAY，Int提供)；PR儀，型號T1/T1+，德國Bietra消費；SP-2102/756型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器消費；凝膠成像系統(tǒng)，BI-RADpany消費。1.3高脂飼料的制備3根底飼料：碳水化合物占60%，蛋白質占22%，脂肪占10%(植物脂肪為主)，其它成分占8%。高脂、高糖飼料由根底飼料加煉豬油10%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%，其中碳

5、水化合物占50%，蛋白質占13%，脂肪占30%(動物脂肪為主)，其它成分占7%，由河北醫(yī)科大學醫(yī)學動物實驗中心加工成飼料顆粒。1.4動物清潔級安康雄性ister大鼠32只，體質量281.1811.38g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供合格證號604104，飼養(yǎng)在室溫2025，相對濕度40%70%的環(huán)境條件下，每籠8只，共分4籠，自由采食、飲水。2方法2.1造模與分組3將上述大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，稱重，隨機分為兩組，第1組8只為正常對照組，喂以根底飼料，第2組24只大鼠用于構造2型糖尿病模型。構造模型組以高脂、高糖飼料飼喂3周后，一次性腹腔注射STZ25g/kg體質量(STZ溶于檸檬酸-檸檬酸鈉

6、緩沖液，所配濃度為10g/l)；對照組腹腔注射相應體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。構造模型組繼續(xù)高糖、高脂飼料飼養(yǎng)4周后，禁食12h，按2g/kg體質量灌喂20%D-葡萄糖溶液，做口服葡萄糖耐量試驗，凡0in和120in血糖分別7.8l/L或葡萄糖負荷后2h血糖11.0l/L的大鼠4為造模成功。選擇造模成功的大鼠24只按體質量編號，參照隨機數(shù)字表法分為3組，分別為模型組、二甲雙胍組、本草消渴丹治療組。各組均繼續(xù)喂以高糖高脂飼料4周，并每周稱體質量。2.2治療第7周后，各組動物分別灌胃相應藥物或生理鹽水，1次/d，給藥按人與大鼠體外表積比折算成等效劑量。對照組、模型組分別每日灌胃等劑量的生理鹽水；

7、二甲雙胍組每日灌胃二甲雙胍70gkg-1，中藥治療組每日灌胃本草消渴丹1.25gkg-1。2.3糖耐量實驗實驗期末空腹8h采尾靜脈血后，以50%葡萄糖溶液灌胃，劑量為2.5g/kg，然后檢測在0，0.5，1，2h后的血糖。由梯形累加法計算血糖曲線下區(qū)域面積areaunderurve，AU，lh-1L-1。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4RT-PR檢測胰腺Bl-2，Bax基因表達程度4周實驗完畢后，各組大鼠斷頸處死，搜集胰腺利用Trizl試劑提取總RNA，逆轉錄合成DNA。根據(jù)NBI中DNA序列設計Bl-2和Bax引物，引物由大連寶生物公司合成，以-atinRNA作為檢測的內(nèi)參照。根據(jù)試劑盒說明進展

8、RT-PR，反響總體系為50l：10neStepRNAPRBuffer5l，gl2(25l/L)10l，dNTPixture(10l/L)5l，RNaseinhibitr(40U/l)1l，AVRTaseXL(5U/l)1l，AV-ptiizedTaq(5U/L)1l，上游特異性引物(20l/L)1l，下游特異性引物(20l/L)1l，RNAsaple(1g)1l，RNaseFreedH224l。取10l樣品在2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描凝膠并進展定量分析，以-atin為標準獲得Bl-2和Bax的相對表達程度。PR反響引物序列產(chǎn)物及退火溫度見表1。表1RT-PR的引物序列、退火溫度和產(chǎn)

9、物長度略2.5數(shù)據(jù)分析應用SPSS15.0的ne-ayANVA進展方差分析，組間進展LSD法多重比擬。3結果3.1實驗前后血糖變化和糖耐量實驗結果實驗開場時，正常組與其他各組的空腹血糖都存在顯著差異P0.05，4周后正常組和模型組的血糖都沒有顯著變化P0.05，而二甲雙胍組和本草消渴丹組的血糖都顯著降低P0.01。本草消渴丹組4周后空腹血糖值顯著低于模型組P0.01，與二甲雙胍組和正常組間的差異無統(tǒng)計學意義P0.05。糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)本草消渴丹組AU顯著高于正常組P0.05，顯著低于模型組P0.05，與二甲雙胍組間的差異無統(tǒng)計學意義P0.05。見表2。表2各組大鼠實驗前后的空腹血糖變化和糖耐量實

10、驗結果略3.2胰腺Bl-2和Bax表達變化本草消渴丹組的Bl-2基因表達程度與正常組和二甲雙胍組間無顯著差異P0.05，與模型組間存在顯著差異P0.05。正常組與其他各組Bax基因的表達都存在顯著差異P0.05，該基因的表達在二甲雙胍組和本草消渴丹組顯著低于模型組P0.05，本草消丹組與二甲雙胍組間無統(tǒng)計學差異P0.05。見表3和圖1。表3Bl-2和Bax的RNA表達程度略與正常組比擬存在顯著差異，*P0.05，與模型組比擬存在顯著差異，P0.054討論現(xiàn)代醫(yī)學認為，胰島細胞的凋亡是糖尿病發(fā)病的重要機制5。凋亡受基因調(diào)控，其中最有效的調(diào)控物質是Bl-2基因家族，它們在凋亡的基因調(diào)控中起著中心作

11、用6。Bl-2Belllypha-Leukeia-2，B細胞淋巴瘤/白血病-2基因是Bl-2家族成員中主要的抗凋亡因子，在抵抗細胞凋亡及延長細胞壽命方面的作用最具代表性，而Bax是凋亡促進基因。它們形成二聚體，調(diào)控蛋白酶和核酸酶活性，雙向調(diào)節(jié)細胞凋亡。二者在細胞中的比例決定了細胞是否凋亡，當Bl-2蛋白在細胞中過量表達時，與所有Bax結合，細胞存活，凋亡抑制；當Bax過量存在，與Bl-2形成異源二聚體，那么細胞凋亡79。中醫(yī)理論認為，糖尿病的主要病證為本虛標實，陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽兩虛三證分別代表糖尿病病程開展的早、中、晚3個不同時期，其中陰虛貫穿本病始終，氣陰兩虛為其根本證候，血瘀為主要

12、兼證10?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明，生地黃為甘寒滋補通利之品，可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞血漿內(nèi)皮素的釋放而發(fā)揮抗血瘀作用11，12；山藥提取物山藥多糖和枸杞的重要成分枸杞多糖均有改善糖尿病鼠受損細胞，降低血糖之成效1316；而山萸肉有補益肝腎，澀精固脫之成效17。中藥復方本草消渴丹是根據(jù)滋陰清熱，潤燥生津這一治那么，在傳統(tǒng)古方根底之上主要選用生地、山藥、枸杞和山萸肉，經(jīng)過現(xiàn)代工藝研制而成的新制劑。本次實驗結果說明，糖尿病對照組胰腺組織中抗凋亡基因Bl-2表達顯著降低，凋亡促進基因Bax顯著升高，而通過灌服二甲雙胍2.13g/10gd后Bl-2表達恢復正常程度，Bax表達雖有降低，但沒有恢復正常程度。灌服

13、中藥復方的糖尿病大鼠的Bl-2表達恢復至正常程度，而Bax表達高于正常大鼠。說明本草消渴丹有上調(diào)糖尿病變大鼠凋亡抑制基因Bl-2表達和下調(diào)凋亡促進基因Bax表達的作用，從而抑制糖尿病胰腺-細胞的凋亡，其效果與二甲雙胍一樣，可以作為治療糖尿病的方劑。【參考文獻】1王芬，何華亮，劉銅華.抗糖尿病中藥活性成分及其作用機制的研究進展J.時珍國醫(yī)國藥，2022，192：766.2李成，楊長青，朱彩鳳.中藥治療糖尿病的研究進展J.時珍國醫(yī)國藥，2022，175：857.3穆松牛，高云，萬福生，等.鏈脲佐菌素加高糖高脂飲食復制大鼠2型糖尿病模型J.中國比擬醫(yī)學雜志，2022，122：19.4周強，金智生，張

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