研究人肝細(xì)胞中總砷及砷代謝產(chǎn)物的分析方法

1、研究人肝細(xì)胞中總砷及砷代謝產(chǎn)物的分析方法【關(guān)鍵詞】細(xì)胞消解高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜肝細(xì)胞砷化學(xué)形態(tài)1引言砷是人體中最豐富12種元素之一，同時(shí)砷也是人類(lèi)確認(rèn)的致癌毒物1,2。長(zhǎng)期接觸砷會(huì)對(duì)人體多種組織、器官造成危害，嚴(yán)重?fù)p害人類(lèi)安康3。近年來(lái)，隨著人們對(duì)安康程度的重視，砷在人體內(nèi)代謝過(guò)程的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。由于砷的毒性很大，因此不能直接進(jìn)展人體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)。有研究報(bào)告不同物種之間的砷代謝過(guò)程存在很大差異，即使與人同屬靈長(zhǎng)類(lèi)的猩猩，其體內(nèi)對(duì)砷代謝與人類(lèi)相比也具有非常大的差異4，因此動(dòng)物體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)只能對(duì)研究人體內(nèi)砷代謝機(jī)理提供一個(gè)參考數(shù)據(jù)。基于此，目前該領(lǐng)域的研究人員多傾向于通過(guò)研究

2、人體細(xì)胞對(duì)外源砷的代謝過(guò)程以提醒砷在人體中的代謝機(jī)理。準(zhǔn)確的砷測(cè)定方法在細(xì)胞中砷代謝過(guò)程的研究中起到至關(guān)重要的作用。目前細(xì)胞中砷元素的總量測(cè)定方法報(bào)道較少，尤其是樣品前處理方法。研究者通常是通過(guò)簡(jiǎn)單的細(xì)胞破碎后直接測(cè)定砷元素含量或者通過(guò)冷消解的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)溶液的均一化5。研究發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞破碎的效率較低，并不能得到穩(wěn)定均一的溶液，而采用冷消解時(shí)消解時(shí)間很難把握，而且消解效率不高。本工作將以hang肝細(xì)胞為研究對(duì)象，在細(xì)胞破碎的根底上比照了3種不同消解方法對(duì)細(xì)胞中砷總量測(cè)定結(jié)果的影響，從而尋找最正確的細(xì)胞消解方法。此外，在總量測(cè)定的根底上，本文將討論細(xì)胞中砷化學(xué)形態(tài)的分析方法，以期為砷代謝機(jī)理的研

3、究提供可用的分析方法學(xué)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑2.2實(shí)驗(yàn)方法參加4lrpi1640培養(yǎng)基內(nèi)含10%胎牛血清、100u/l的青、鏈霉素)。將細(xì)胞繼續(xù)在2培養(yǎng)箱中放置24h，待細(xì)胞完全貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，分別參加用培養(yǎng)基配制的終濃度為1、5、10和20l/l的naas2溶液，37、5%2孵育24h。在到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用pbs反復(fù)沖洗。用細(xì)胞刷刮下六孔板各孔內(nèi)貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到5.0l離心管中(每管大約1.0l樣品，約含2.5106個(gè)細(xì)胞)，超聲破碎后密封，于70下進(jìn)展保存。以砷計(jì)儲(chǔ)藏液。3結(jié)果與討論3.1不同處理方法砷總量測(cè)定比照生物樣品的消解處理方法多采用濕法消解，而濕法

4、消解包括敞開(kāi)式濕法消解和密閉濕法消解。雖然敞開(kāi)式消解步驟簡(jiǎn)單，樣品處理量大，但由于砷即便在較低溫度就可轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的二聚物或單氧化物從而造成損失，因此敞開(kāi)式消解并不合適砷的測(cè)定。所以密閉濕法消解是生物樣品中砷s前處理方法的首眩密閉濕法消解是在密閉空間內(nèi)采用強(qiáng)酸性或強(qiáng)氧化性的試劑對(duì)樣品進(jìn)展液體化、均一化的過(guò)程，其又可分為高壓密閉容器消解、微波消解、冷消解等方法。密閉容器消解與微波消解法均在密閉消解罐中用強(qiáng)酸消化處理樣品，區(qū)別在于前者采用在烘箱中外加熱消解罐使樣品消解，而后者那么利用微波的穿透性和激活才能，內(nèi)加熱密閉容器中的試劑和樣品，而冷消解法主要是針對(duì)有機(jī)物含量較低的樣品的消解方法。其不通過(guò)加

5、熱僅靠試劑本身的酸性和氧化性對(duì)樣品進(jìn)展消化。表2顯示了不同消解方法之間的比照結(jié)果。從表2中可看出，用微波消解法和高壓密閉消解法處理樣品時(shí)細(xì)胞內(nèi)砷總量測(cè)定的差異較小，而用冷消解和直接進(jìn)樣法時(shí)坤測(cè)定的結(jié)果那么低于其它兩種方法的結(jié)果，尤其是用直接進(jìn)樣法測(cè)定的結(jié)果僅為用微波消解法時(shí)的50%左右。屢次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏向(rsd)說(shuō)明，當(dāng)用微波消解、高壓密閉消解法時(shí)，屢次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏向最小，其次為冷消解方法，最次為直接進(jìn)樣測(cè)定。這可能是由于細(xì)胞樣品破碎不完全，樣品中殘留未破碎的細(xì)胞，因此直接進(jìn)樣測(cè)定時(shí)，樣品測(cè)定的穩(wěn)定性稍遜于消解后的樣品。而通過(guò)冷消解處理后的樣品，雖然樣品的均一性有了進(jìn)步，但是相對(duì)于加

6、熱消解的方法來(lái)說(shuō)尚有差距。微波消解法和高壓密閉消解法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，但后者耗時(shí)長(zhǎng)、易引入污染;而前者耗時(shí)短，空白低，易揮發(fā)元素砷損失更少。根據(jù)以上的比較，本工作選擇微波消解法進(jìn)展細(xì)胞樣品處理。表24種消解方法測(cè)定染砷細(xì)胞中砷總量的比較(n=3)略table2parisnf4digestinethdsg/l,n=33.2干擾及消除應(yīng)用ips進(jìn)展分析生物樣品中砷的測(cè)定干擾問(wèn)題需要解決。其干擾包括質(zhì)譜干擾和非質(zhì)譜干擾兩類(lèi)。質(zhì)譜干擾的產(chǎn)生是由于生物樣品中的35l元素含量一般較高，35l與等離子體中的載氣ar2形成40ar35l多原子離子影響測(cè)定結(jié)果。本工作通過(guò)稀釋樣品來(lái)降低l濃度，并采用優(yōu)化儀

7、器條件和選擇適宜的干擾校正方程來(lái)進(jìn)展測(cè)定校正。實(shí)驗(yàn)中編輯干擾方程75as7577(3.127)+82(2.733)83(2.757)來(lái)校正砷的多原子離子干擾。非質(zhì)譜干擾主要源于樣品基體，基體效應(yīng)會(huì)對(duì)待測(cè)元素產(chǎn)生抑制作用?？酥苹w效應(yīng)最有效的方法是稀釋樣品、內(nèi)標(biāo)校正、標(biāo)準(zhǔn)參加、基體消除等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)參加1.0g/l89y溶液作內(nèi)標(biāo)在線監(jiān)測(cè)信號(hào)變動(dòng)情況，可有效克制儀器漂移，保證測(cè)量的準(zhǔn)確性。3.3線性范圍及精細(xì)度用種方法對(duì)1l/l染砷組平行測(cè)定7次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏向考察精細(xì)度，結(jié)果見(jiàn)表3。表中結(jié)果顯示，與微波消解和高壓密閉消解法相比，直接進(jìn)樣和冷消解的精細(xì)度明顯偏低。而高壓密閉消解法(rsd=1

8、.21)的當(dāng)日精細(xì)度略優(yōu)于微波消解法(rsd=2.1)。此外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4種前處理方法處理后1l/l染砷組的樣品連續(xù)測(cè)定6d每天一次得到了不同方法的日間精細(xì)度，結(jié)果列于表3。由表3可見(jiàn)，直接進(jìn)樣的日間精細(xì)度最差，其次為冷消解，其rsd均超過(guò)10。而其它種方法均顯示了較高的日間精細(xì)度。比照微波消解法和高壓密閉消解法的精細(xì)度發(fā)現(xiàn)，雖然高壓密閉消解法的日內(nèi)精細(xì)度較高，但其日間精細(xì)度略高于微波消解法。表3測(cè)定精細(xì)度及日間精細(xì)度測(cè)定略表4檢出限及加標(biāo)回收率測(cè)定略table4detetinliitsandspikerevery3.4方法檢出限及回收率平行測(cè)定11次空白溶液，計(jì)算3倍的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏向，其對(duì)應(yīng)

9、的濃度值為其檢出限，結(jié)果見(jiàn)表4。由于缺少細(xì)胞樣品的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用加標(biāo)回收的方法判斷測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。對(duì)于5l/l組染砷樣品參加濃度相當(dāng)于100本底濃度的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用4種方法平行處理加標(biāo)樣品，最后測(cè)定溶液中砷含量，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。回收率實(shí)驗(yàn)顯示除直接進(jìn)樣外，其它3種消解方法的回收率均在84.1%108.1之間，顯示了較好的方法準(zhǔn)確性。3.5細(xì)胞樣品中有機(jī)砷形態(tài)的測(cè)定無(wú)機(jī)砷主要指ias進(jìn)入人體后，在酶的作用下會(huì)發(fā)生甲基化作用，這是人體砷代謝的主要途徑68。砷在人體的甲基化過(guò)程主要發(fā)生在肝臟中，肝臟是人體代謝外源砷的主要器官910。目前對(duì)肝臟中砷甲基化的機(jī)理尚不清楚，但是通

10、過(guò)對(duì)肝臟中甲基化砷主要為a和da以及一些中間代謝產(chǎn)物的測(cè)定和表征可以反映人體對(duì)砷的代謝程度，尤其是對(duì)慢性砷中毒的患者，通過(guò)對(duì)其體內(nèi)甲基化砷的測(cè)定可以斷定其代謝情況，從而對(duì)其治療效果提供一個(gè)可評(píng)判的根據(jù)。另一方面，通過(guò)對(duì)肝臟中砷代謝產(chǎn)物的測(cè)定和表征可以對(duì)其代謝機(jī)理研究的準(zhǔn)確性提供直觀的斷定。1.arsenhline(as)；2.arsenbetaine(asb)；3.as()；4.diethylarsiniaid(da)；hylarsiniaid(a)；6.as().a.未經(jīng)h22處理ithuth22treatent；b.經(jīng)h22處理(ithh22treatent).雖然目前對(duì)肝臟中砷甲基化的假

11、說(shuō)很多，但有一點(diǎn)已達(dá)成共識(shí)11,12：無(wú)機(jī)砷在肝臟內(nèi)的代謝過(guò)程遵循一個(gè)根本的流程即as()首先復(fù)原為as()，而后通過(guò)甲基化作用首先形成a。a通過(guò)一系列中間代謝產(chǎn)物再次甲基化形成da，而da為肝臟甲基化代謝無(wú)機(jī)砷的最終產(chǎn)物9。圖a中顯示da的存在,說(shuō)明砷在肝細(xì)胞中的甲基化作用確實(shí)存在?？紤]到譜圖2a中未發(fā)現(xiàn)a，因此可以推測(cè)未知峰可能為a發(fā)生二次甲基化過(guò)程中的中間代謝產(chǎn)物.為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)在該樣品中參加了適量的h22，靜置4h后重新測(cè)定其含有的砷形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖。比照?qǐng)D2和圖2可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)h22處理樣品后，原來(lái)存在的未知峰和as()均不存在了，取而代之的是出現(xiàn)了a的色譜峰且as()峰的面積

12、增大25左右(as()氧化的結(jié)果)。有報(bào)道指出13，適量的h22可以使砷與巰基結(jié)合鍵斷裂。由此可以推斷未知峰極有可能為a甲基化為da時(shí)的中間代謝產(chǎn)物。由于目前各種砷在肝臟中代謝理論的假說(shuō)的不同點(diǎn)表達(dá)在砷甲基化的中間代謝產(chǎn)物上11，12，即假設(shè)能準(zhǔn)確表征砷代謝的中間產(chǎn)物即可斷定各種假說(shuō)的真實(shí)性。因此本工作所建立的別離方法對(duì)砷代謝理論的發(fā)現(xiàn)可提供了重要的支持。4結(jié)論【參考文獻(xiàn)】1nr:natinalresearhunilreprt:arseniinthedrinkingater.ashingtn,d:natinalaadeypress,19992gerledr,spaldingj,yuhs,hen

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