基因定量課件

1、基 因 定 量RNA豐度的檢測(cè)方法Northern 印跡RNA狹縫印跡分析RNase保護(hù)測(cè)定法S1雜交定量PCR定量PCR定量PCR可分為四類非競(jìng)爭(zhēng)性PCR競(jìng)爭(zhēng)性PCRPCRELISA法 Real Time PCR一、非競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR基本原理 非競(jìng)爭(zhēng)性定量pcr技術(shù)是用一種內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)作為對(duì)照來估計(jì)出一種特異性靶DNA或RNA分子相對(duì)含量的方法?；驹囼?yàn)步驟包括RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)等。 內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)通常是管家基因序列，一般認(rèn)為管家基因的mRNA在同一種生物的不同個(gè)體、不同發(fā)育階段以及不同組織中的表達(dá)量變化相對(duì)穩(wěn)定，故可通過比較靶序列與內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增產(chǎn)物的含量來對(duì)靶序列進(jìn)行定

2、量。常用的內(nèi)參有actin，GAPDH等。目的基因看家基因PCR循環(huán)條件的優(yōu)化： 產(chǎn)物變化的敏感區(qū)出現(xiàn)在指數(shù)增長(zhǎng)期，確保目的基因和內(nèi)參照基因在盡可能相同的條件下、以相似的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)在對(duì)數(shù)期內(nèi)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增是比較基因變化的前提。 cDNA在不同循環(huán)數(shù)下PCR產(chǎn)物變化的電泳圖cDNA在不同循環(huán)數(shù)下PCR過程的動(dòng)力學(xué)曲線PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法a.聚丙烯酰氨凝膠電泳或瓊脂糖電泳，同位素標(biāo)記，放射 自顯影；b.聚丙烯酰氨凝膠電泳或瓊脂糖電泳，EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；c. HPLC；d. 熒光標(biāo)記法。二、競(jìng)爭(zhēng)性PCR基本原理 選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管

3、中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù) 。三、PCRELISA法利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物在固相板上被特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCRELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的 。四、實(shí)時(shí)PCR（Real Time PCR） 所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光

4、基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 實(shí)時(shí)PCR與常規(guī)定量PCR的區(qū)別 由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 相同模板在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖 終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性 。 一、SYBR Green的基本原理：

5、 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)二、Molecular Beacons的基本原理：原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)三、TaqMan探針的基本原理TaqMan 工作原理TaqMan 工作原理我們的工作一、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄二、傳統(tǒng)的半定量PCR三、熒光引物作半定量PCR四、定量PCR一、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 處理時(shí)間（H）處理方式612244872144WSSV感染333333注射正常蝦組織333333弧菌感染333333注射生理鹽水3

6、33333空白對(duì)照333333血淋巴：每組取三個(gè)樣品，分別提取RNA，并作反轉(zhuǎn)錄；肌 肉：每組取三個(gè)樣品，提取RNA后等量混在一起作反轉(zhuǎn)錄。二、傳統(tǒng)的半定量RT-PCR 目的基因：抗菌肽（Pnaeidin） 內(nèi)參基因： GAPDHRNA提取反轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR瓊脂糖凝膠電泳VDS照相掃描分析數(shù)據(jù)處理，作出曲線流程三、熒光引物半定量RT-PCR 目的基因：抗菌肽（Pnaeidin） （正向引物標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)） 內(nèi)參基因： actin （正向引物標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)）RNA提取反轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR核酸測(cè)序儀進(jìn)行電泳(GENSCAN-500)作出曲線流程數(shù)據(jù)的收集和分析試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果

7、試驗(yàn)結(jié)果四、實(shí)時(shí)定量PCR目的基因：抗菌肽（Pnaeidin） 內(nèi)參基因： 18s rDNA 儀器：ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 試劑：TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit探針：TaqMan ProbeTarget gene Target gene: penaeidinUpstream primers (21bps), 5ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTG3 Downstream primers (20bps), 5ACAGCAACGTCCAAACCGAC3Probe（24b

8、ps: 72-95）HEX5-CACACGCCCGATATCCAGACCACC-3 TAMARA ) penaeidin (189bps)：atg cgc ctc gtg gtc tgc ctg gtc ttc ttg gcc tcc ttc gcc ctg gtc tgc caa ggg caa aag ggt ggt tac aca cgc ccg ata tcc aga cca ccc tat ggg gga gga tat ggc aat gtt tgc act tca tgc cac gtt ctt acc acc tca caa gct cgt tct tgc tgc agt cg

9、g ttt gga cgt tgc tgtHEX: Endogenous geneEndogenous gene: 18s rDNAUpstream primers (25bps), 5 -TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3， Downstream primers (25bps), 5-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3）136 bpProbe（26bps:69-95） (FAM)5TCAGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGC-318s rDNA (136bps)：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAG

10、GTTAAACGCCTACAATGGCTATCACGGGTAACGGGGAATCAGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTFAM: fluorescent dyes 5-carboxyfluoroscein總 RNA 的制備 引物和探針的設(shè)計(jì)（ Primer Express Software v2.0） 引物用量?jī)?yōu)化 探針用量?jī)?yōu)化 模板用量?jī)?yōu)化 擴(kuò)增效率檢測(cè) 在96孔板上進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng) 數(shù)據(jù)分析工作流程條件優(yōu)化的結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果PCR擴(kuò)增曲線試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果比較結(jié)論：W

11、SSV和弧菌感染后，對(duì)蝦肌肉和血淋巴中抗菌肽的表達(dá)量均發(fā)生了相似的變化，但肌肉中的變化不像血淋巴中那樣強(qiáng)烈；WSSV感染后抗菌肽的表達(dá)量迅速降低，然后馬上回升，最后有降低，甚至到正常水平一下；弧菌感染后抗菌肽的表達(dá)量也有一個(gè)降低的過程，到24小時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，而后緩慢上升，一致超出正常水平，而且延續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。定量PCR半定量PCR定量與半定量PCR之比較定量PCR半定量PCR定量與半定量PCR之比較定量PCR半定量PCR定量與半定量PCR之比較定量PCR半定量PCR定量與半定量PCR之比較對(duì)半定量PCR的評(píng)價(jià)a. 靈敏度高： mRNA表達(dá)定量是一種挑戰(zhàn)性的RT-PCR，但是提供了超越傳統(tǒng)RNA分

12、析方法的優(yōu)點(diǎn)。RT-PCR比Northern印跡或核酸酶保護(hù)分析更靈敏，需要的RNA量及序列信息較少。 b. 操作簡(jiǎn)便： 不一定必須同位素，試驗(yàn)周期短。c. 誤差較大： RT-PCR涉及兩個(gè)酶反應(yīng)，這會(huì)導(dǎo)致RT-PCR產(chǎn)物量的波動(dòng)。RNA轉(zhuǎn)化成cDNA的量會(huì)影響產(chǎn)量，樣品間很小的差異會(huì)被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物產(chǎn)量間很大的差異，變異系數(shù)通常達(dá)到1020。d. 重復(fù)性較差： 同一批樣最好一次完成。 對(duì)定量PCR的評(píng)價(jià)a. 靈敏度高： 定量PCR具有比半定量PCR更為靈敏的檢測(cè)能力，RNA的檢出量未pg級(jí)。 b. 操作簡(jiǎn)便： 反轉(zhuǎn)錄、PCR、數(shù)據(jù)獲得和分析可以一步進(jìn)行，整個(gè)過程只需23個(gè)小時(shí)。c. 誤差?。?解

13、決了終點(diǎn)檢測(cè)的問題大大提高了定量PCR的準(zhǔn)確性，可與Northern媲美。d. 重復(fù)性好： 但最好要求同一批樣品在同一塊板上完成。e. 絕對(duì)定量： 引入標(biāo)準(zhǔn)曲線后能夠絕對(duì)定量。 f. 比較昂貴 半定量PCR和定量PCR的原理不同，但均能對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，因此能較好地反映基因的轉(zhuǎn)錄水平，尤其是對(duì)于在通常情況下不表達(dá)的基因，這兩種方法能夠很好地反映新的基因轉(zhuǎn)錄變化。但是，基因的轉(zhuǎn)錄，并不是基因表達(dá)的全部，轉(zhuǎn)錄后需要經(jīng)過翻譯及翻譯后修飾才成為蛋白質(zhì)，這個(gè)過程又受眾多因素的影響。包括mRNA的加工，穩(wěn)定性，翻譯的效率，蛋白質(zhì)合成后的修飾和運(yùn)輸?shù)?，最終都會(huì)影響蛋白質(zhì)的水平。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的水平，有時(shí)也不能說明基因表達(dá)的水平，因?yàn)樵谕ǔＧ闆r下，細(xì)胞內(nèi)存在蛋白貯備的情形，這些蛋白是在先前合成的，并不是新合成的，可能以蛋白原的形式存在，也可能以非活性的其它形式存在，在細(xì)胞功能需要的時(shí)候，經(jīng)過化學(xué)修飾，如磷酸化而成為有活性的蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮相應(yīng)的作用。例如抗菌肽，存在于血細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)有病原入侵，即可從細(xì)胞質(zhì)釋放到血淋巴中，并發(fā)生剪切等一系列變化，成為有活