抗菌肽及抗菌分子機(jī)理課件

1、抗菌肽及抗菌分子機(jī)理07202 張琳琪 馮瑤概述抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的總稱,這些短肽分子量在20007000左右,由2060個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性及廣譜抗菌等特點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,抗菌肽已成為近年來(lái)分子免疫學(xué)和分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。研究的內(nèi)容包括:抗菌肽的分離與提純,氨基酸序列的分析,蛋白質(zhì)構(gòu)型與功能的關(guān)系;抗菌肽的作用機(jī)理；應(yīng)用基因工程克隆和表達(dá)抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及動(dòng)植物的轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程等,其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成,在機(jī)體抵抗病原體的入侵方面起

2、著重要的作用,被認(rèn)為是生物非特異性免疫功能的重要防御成分?？咕木哂袕V譜殺菌作用,對(duì)某些真菌、原生動(dòng)物,耐藥性細(xì)菌都有殺滅作用,并可選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制乙型肝炎病毒等的復(fù)制?？咕牡姆诸惼駷橹箯牟煌矬w內(nèi)誘導(dǎo)獲得的抗菌肽已有200多種,僅從昆蟲體內(nèi)分離得到的就有170余種。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可把抗菌肽分為5類:單鏈無(wú)半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由無(wú)規(guī)則卷曲連接的兩段-螺旋組成的肽。該類包括天蠶素Cecropins, Ma-gainins等。Magainins最初是從非洲爪蟾的皮膚中發(fā)現(xiàn)的,它是爪蟾的皮膚在一定的環(huán)境壓力下分泌出的抗感染和促進(jìn)傷口愈合的成分,由兩個(gè)緊密相連的肽鏈組成,每一個(gè)

3、肽鏈有23個(gè)氨基酸,低濃度便可抑制許多細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)。富含某些氨基酸殘基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)殘基的抗菌肽。如從豬腸內(nèi)分離的抗菌肽PR39中Pro含量占49%。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly。含一個(gè)二硫鍵的抗菌肽,該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。如爪蟾皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生的Brevinins。有兩個(gè)或兩個(gè)以上二硫鍵,具有-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phormindefensin),分子內(nèi)有6個(gè)Cys形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵,肽鏈C末段是帶有擬-轉(zhuǎn)角的反向平行的片層。實(shí)驗(yàn)證明,分子中的二硫鍵在其抗菌作用中至關(guān)重

4、要。由其他已知功能較大的多肽衍生而來(lái)的具有抗菌活力的肽。31胞膜攻擊作用大多數(shù)抗菌肽基本的作用機(jī)制是破壞腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌的死亡,而抗菌肽分子的結(jié)構(gòu)特征是保證上述機(jī)制發(fā)揮作用的重要基礎(chǔ)。昆蟲天蠶素的抗菌肽分子是通過(guò)其兩親性-2螺旋上的正電荷與細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂分子上負(fù)電荷之間的靜電吸引而結(jié)合聚集在質(zhì)膜上,然后抗菌肽分子中的疏水段C端(酰胺基)-2螺旋插入到疏水的細(xì)菌細(xì)胞膜中央,雙親的-2螺旋留在質(zhì)膜表面,打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序,使得膜外正電荷增多,超過(guò)閾值導(dǎo)致膜去極化。由于抗菌肽分子的-2螺旋是親、疏水兩親性的,所以當(dāng)抗菌肽分子相

5、互聚集在一起時(shí)可形成離子通道,導(dǎo)致陽(yáng)離子外流,最后細(xì)菌失去保護(hù),不能保持正常的滲透壓而死亡。從豬小腸中分離得到的抗菌肽(Cecp) 也是通過(guò)膜攻擊來(lái)完成對(duì)細(xì)菌的殺傷,但其C端為羧基而非酰胺基,其抗菌譜也有所不同,其作用機(jī)制主要是通過(guò)堿性氨基酸與細(xì)菌外膜表面的磷脂酰頭部結(jié)合,由于分子的旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致Cecp的疏水基與膜的疏水區(qū)結(jié)合,超過(guò)閾值時(shí),則在質(zhì)膜上形成瞬時(shí)小孔,導(dǎo)致菌體內(nèi)容物溢出,菌體裂解死亡。防御素作用于細(xì)胞膜,可增加生物膜的通透性而發(fā)揮作用。在人工脂質(zhì)膜的實(shí)驗(yàn)顯示,防御素作用于膜上形成穩(wěn)定的通道,且具有依賴電壓的傳導(dǎo)特性，因?yàn)榉烙胤肿雍苄?不能以單聚體的形式造成膜穿孔,但防御素分子能以多聚

6、體的形式作用于胞膜。33線粒體攻擊作用Bobek等以人唾液中提取的抗菌肽MUC7作用于臨床常見(jiàn)的真菌、桿菌和球菌,發(fā)現(xiàn)MUC7對(duì)真菌和細(xì)菌都有很強(qiáng)的殺傷作用。在超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴脫落和不規(guī)則排列,核膜界限不清,有的核破裂,內(nèi)容物溢出。這表明抗菌肽MUC7的作用機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞呼吸有關(guān)。Chen等也發(fā)現(xiàn)抗菌肽Tachy-plesin的作用機(jī)制與抑制線粒體相關(guān)的caspase7和caspase6蛋白有關(guān)。Fehlaum等發(fā)現(xiàn)Thanatin在0. 3 0. 6mol/L時(shí),就對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺菌作用。但當(dāng)其濃度提高到70mol/L時(shí),仍然檢測(cè)不到細(xì)胞內(nèi)K+的泄漏,

7、提示Thanatin不是通過(guò)形成離子通道來(lái)殺滅細(xì)菌。當(dāng)利用40mol/L的Thanatin處理細(xì)菌時(shí), 1h后可檢測(cè)到細(xì)胞的呼吸作用變?nèi)?6h后完全停止。因此認(rèn)為Thanatin通過(guò)抑制細(xì)胞呼吸作用來(lái)殺菌的。34對(duì)細(xì)胞核染色體的影響以往的研究多集中于抗菌肽對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用,但Hariton等用具有同源性的兩種抗菌肽dermaseptinS4,dermaseptinS4 (13)作用于HeLa腫瘤細(xì)胞株,熒光免疫染色發(fā)現(xiàn)S4不能進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)部;S4(13)M r較小,可以進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部,但不能結(jié)合到細(xì)胞核上。對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列加工改造后獲得的新型抗菌肽PVS4 (13)、RRS4(13)卻

8、具有更強(qiáng)的穿透性,同時(shí)也可以結(jié)合到腫瘤的細(xì)胞核上。結(jié)果表明,經(jīng)這兩種改造后的抗菌肽作用后的腫瘤細(xì)胞DNA出現(xiàn)斷裂,并最終導(dǎo)致死亡,由此推測(cè)抗菌肽可以通過(guò)直接作用于腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)發(fā)揮殺傷作用。35對(duì)癌細(xì)胞骨架的斷裂作用Chen等研究了天蠶素B、B1和B3的抗腫瘤作用機(jī)制,這3種抗菌肽在空間結(jié)構(gòu)和氨基酸序列上存在著一定差異,但又有一定的同源性。通過(guò)作用于體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn),3種抗菌肽都可以使細(xì)胞的雙分子層發(fā)生溶解,微管崩解,腫瘤細(xì)胞皺縮、死亡。并且發(fā)現(xiàn)這種殺傷作用的效率與3種抗菌肽的空間結(jié)構(gòu)和成分密切相關(guān),證實(shí)了抗菌肽不僅可以使細(xì)胞膜發(fā)生穿孔,而且還可以破壞微管的正常功能,影響細(xì)胞骨架的完整性,阻止紡錘絲形成和有絲分裂,進(jìn)而破壞細(xì)胞器,殺傷腫瘤細(xì)胞。雖然抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常人體細(xì)胞的細(xì)胞骨架均有一定損傷,但后者骨架系統(tǒng)完整,修復(fù)快,不會(huì)造成不可逆損傷。而腫瘤細(xì)胞骨架不完整,經(jīng)抗菌肽作用后,得不到及時(shí)修復(fù),最終導(dǎo)致死亡。抗菌肽的應(yīng)用前景抗菌肽與上皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、溶酶體等共同構(gòu)成了機(jī)體的非特異性防御系統(tǒng),在體內(nèi)具有直接的殺菌活性。