重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件

1、基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程?；蚬こ淌侵钢亟MDNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和優(yōu)點(diǎn)：1、可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽；去除內(nèi)源性物質(zhì)的不足之處2、提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以進(jìn)行生理生化、結(jié)構(gòu)的研究3、利用基因工程技術(shù)可發(fā)現(xiàn)、挖掘更多內(nèi)源性生理活性物質(zhì)4、獲得新型化合物優(yōu)點(diǎn)：主要基因工程產(chǎn)品的研制、開(kāi)發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品人生長(zhǎng)激素釋放抑制素（SRM)人胰島素首次克隆表達(dá)時(shí)間國(guó)家用途首

2、次進(jìn)入市場(chǎng)時(shí)間國(guó)家/地區(qū)1977日本治療巨人癥1978美國(guó)治療糖尿病1982歐洲人生長(zhǎng)激素（HGH)1979美國(guó)治療侏儒癥1985美國(guó)人干擾素（ IFN)1980美國(guó)治療病毒感染癥1985美國(guó)乙肝疫苗1983美國(guó)預(yù)防乙型肝炎1986歐洲人白細(xì)胞介素21984日本治療腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素治療貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子治療中性白細(xì)胞減少癥1991美國(guó)人組織纖溶酶原激活劑（t-PA)治療血栓癥1987美國(guó)主要基因工程產(chǎn)品的研制、開(kāi)發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品人生長(zhǎng)激素釋放抑制DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切與連）載體的選擇受體細(xì)胞的選擇重組DNA分子轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)

3、化子的篩選與鑒定（選）外源基因的大規(guī)模表達(dá)和分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)和制劑制備DNA重組藥物制造的主要步驟獲得目的基因DNA的體外重組（切重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件二、基本過(guò)程上游階段： 實(shí)驗(yàn)室 獲得目的基因、酶切和酶連、插入適當(dāng)載體、轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞、復(fù)制、目的基因分析確證、表達(dá)、篩選合適表達(dá)系統(tǒng)等下游階段：將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化 發(fā)酵參數(shù)確定、新型生物反應(yīng)器研制、高效分離介質(zhì)及裝置開(kāi)發(fā)、生物傳感器設(shè)計(jì)制造、電子計(jì)算機(jī)優(yōu)化控制、產(chǎn)品質(zhì)量控制注意：上游DNA重組的設(shè)計(jì)必須以簡(jiǎn)化下游操作工藝和裝備為指導(dǎo)思想；而下游過(guò)程則是上游基因重組藍(lán)圖的體現(xiàn)和保證，這是基因工程產(chǎn)業(yè)化的基本原則。二、基本過(guò)程上游階段： 實(shí)驗(yàn)

4、室注意：上游DNA重組的設(shè)計(jì)必須1、目的基因的獲得1）、鳥(niǎo)槍法（基因文庫(kù)） 基因組DNA提取 限制性內(nèi)切酶部分水解與載體連接轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與篩選2）、逆轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫(kù)） mRNA純化cDNA第一合成第二鏈合成 cDNA克隆將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 cDNA文庫(kù)鑒定目的cDNA克隆的分離和鑒定3）、合成法4）、PCR法1、目的基因的獲得1）、鳥(niǎo)槍法（基因文庫(kù)）4、PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 典型PCR反應(yīng)包括 模板變性 94以上（12） 退火 5055（12） 延伸 72（12） 在高溫聚合酶作用下， 以DNA單鏈為模板， 由引物起始從53 延伸。4、PCR法或逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PC

5、R）(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的擴(kuò)增(a)53引物13 535引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長(zhǎng)度的鏈不同長(zhǎng)度的鏈5335引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長(zhǎng)度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)(c)(b)引物2533355(d)新引物535335靶DNA片段引物A5 5引物A33PCRPCRPCR3 355PCR引物B引物C5 533混合,變性,退火53533535+DNA聚合酶53355335用引物B和C作PCRPCR定點(diǎn)誘變PCR用于基因突變5335靶DNA片段引物A5 5引物A33重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件化學(xué)合成法

6、 在已知DNA序列或多肽的一般結(jié)構(gòu)時(shí)，如鏈長(zhǎng)在 60bp100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA?；瘜W(xué)合成法重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件2、基因表達(dá)1）、選擇宿主細(xì)胞 原核 大腸桿菌：生長(zhǎng)快；遺傳研究深入；產(chǎn)品多為胞內(nèi)（包含體）或周質(zhì)中；不能糖基化修飾。需注意內(nèi)毒素污染。 枯草芽孢桿菌： 分泌力強(qiáng)，不形成包含體；不修飾；胞外酶可能會(huì)降解產(chǎn)物 鏈霉菌：分泌能力強(qiáng)；不致病，安全；有糖基化能力。2、基因表達(dá)1）、選擇宿主細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短 缺點(diǎn)：多為胞內(nèi)表達(dá)、提取困難，易生成包含體、含起始密碼Met(AUG)，有內(nèi)毒素毒性優(yōu)點(diǎn)：易大量生產(chǎn)，成本低，周期短真核酵母：研究基因表達(dá)調(diào)控最有效

7、的單細(xì)胞真核微生物；基因組小，僅為大腸桿菌4倍；傳代時(shí)間短；無(wú)毒；有分泌功能和修飾功能；已用于干擾素、乙肝表面抗原等重組DNA藥物的生產(chǎn)。絲狀真菌：有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，能正確加工，糖基化方式與高等生物相似，有成熟發(fā)酵和后處理工藝哺乳動(dòng)物細(xì)胞：類似天然產(chǎn)物，但培養(yǎng)條件苛刻真核大腸桿菌與真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)比較大腸桿菌: 發(fā)酵 包含體 復(fù)性 純化 目的蛋白真核細(xì)胞:發(fā)酵 上清液 純化 目的蛋白大腸桿菌與真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)比較大腸桿菌: 大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白易形成包含體 高效表達(dá)的目的蛋白 在大腸桿菌內(nèi)形成大 量無(wú)活性包含體。 因無(wú)法有效的解決復(fù) 性問(wèn)題，在美國(guó)每年 造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá) 幾十億美元

8、包含體電鏡圖大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白易形成包含體 高效表達(dá)的目的蛋白包含體蛋白質(zhì)復(fù)性概念將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無(wú) 活性的狀態(tài)，恢復(fù)到有唯一 立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的 狀態(tài)的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。蛋白質(zhì)復(fù)性概念將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)則、無(wú) 2）、表達(dá)載體 要求：a、能獨(dú)立復(fù)制b、有靈活的多克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記c、具有有效運(yùn)載外源基因的能力，能攜帶大小不同的外源基因d、容易控制，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，安全可靠。2）、表達(dá)載體 如大腸桿菌的pBV220系統(tǒng)，為溫度誘導(dǎo)表達(dá)載體，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等 pET系統(tǒng)，最有潛力的系統(tǒng)，可用乳糖代替IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖），產(chǎn)物可達(dá)細(xì)胞總蛋白

9、2030%，表達(dá)量可達(dá)總蛋白50%。重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件pET載體pET載體 3）、構(gòu)建工程菌 目的基因與載體DNA的連接重組DNA向宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移篩選與鑒定帶有目的基因的陽(yáng)性克隆影響目的基因表達(dá)的因素 3）、構(gòu)建工程菌三、重組藥物的分離純化 A 重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則 針對(duì)不用的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用合適分離純化介質(zhì)的選擇分離純化過(guò)程的規(guī)?；?、重組藥物的分離純化A 重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略 采用分泌型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用

10、沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理； 采用包涵體型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體； 采用融合型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進(jìn)行純化 表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然有再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。針對(duì)不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型 等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（大于8或小于5）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白； 重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親和層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標(biāo)蛋白之間的解離常數(shù)應(yīng)在合適的范圍內(nèi)（108104mol/L）;

11、 疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進(jìn)行分離的； 凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進(jìn)行分離的； 徑向?qū)游鍪墙陙?lái)發(fā)展起來(lái)的集層析分離和膜分離于一體的一種復(fù)合技術(shù)，在流量、負(fù)荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。針對(duì)不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用 在進(jìn)行重組蛋白的純化時(shí)，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來(lái)說(shuō)，在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則： 應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用 應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法 應(yīng)盡量選擇高效的分離方法 應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用合適分離純化介質(zhì)的選擇常用的蛋白質(zhì)分離

12、純化介質(zhì)有Sephadex和Sepharose。理想的分離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)： 對(duì)目標(biāo)蛋白具有較高的分辨效率 對(duì)目標(biāo)蛋白不會(huì)造成變性 化學(xué)性能和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好 價(jià)格低廉合適分離純化介質(zhì)的選擇分離純化過(guò)程的規(guī)?；?蛋白質(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過(guò)程未必合適，如： 實(shí)驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁） 實(shí)驗(yàn)室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過(guò)高（超速離心） 因此，在很多情況下，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。分離純化過(guò)程的規(guī)模化四、質(zhì)量控制1、原材料質(zhì)量控制： 2、培養(yǎng)過(guò)程質(zhì)量控制 3、純化工藝質(zhì)量控制 4、目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量控制 四、質(zhì)量控制1、原材料質(zhì)量控制：

13、保證編碼DNA序列正確 要了解以下特性： A、目的基因來(lái)源、克隆過(guò)程、序列 B、表達(dá)載體名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及酶切圖譜、抗生素標(biāo)記等 C、宿主名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及生物學(xué)特征 D、載體引入宿主方式、及載體再宿主中狀態(tài) E、插入基因于表達(dá)載體兩側(cè)控制區(qū)核酸序列 F、啟動(dòng)和控制克隆基因表達(dá)的方法及水平保證編碼DNA序列正確種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應(yīng)出現(xiàn)無(wú)突變或質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象種子批系統(tǒng)工作細(xì)胞庫(kù)種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)工程中工程菌不應(yīng)出現(xiàn)無(wú)突變或質(zhì)粒丟盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白等雜質(zhì)，并避免在純化過(guò)程帶入有害物質(zhì) 純化每一步應(yīng)測(cè)定純度、計(jì)算提純倍數(shù)、收率等等盡

14、量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白等雜質(zhì)，并避免在純化過(guò)1）、產(chǎn)品的鑒別氨基酸組成分析： 肽圖分析：N末端和C末端氨基酸測(cè)序：蛋白質(zhì)二硫鍵的分析：重組蛋白相對(duì)分子量：等電點(diǎn)的測(cè)定：2）、純度分析：SDS, CE, IEF, HPLC3）、生物活性測(cè)定4）、殘余雜質(zhì)檢測(cè) 宿主細(xì)胞蛋白含量、宿主細(xì)胞DNA、殘余抗生素等5）、安全性檢測(cè) 無(wú)菌實(shí)驗(yàn)、熱原實(shí)驗(yàn)、毒性實(shí)驗(yàn)、免疫原性檢查1）、產(chǎn)品的鑒別A 體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定方法 生物學(xué)模型 生長(zhǎng)激素 大鼠 腦垂體B 體外生物學(xué)活性測(cè)定方法 如： MTT法: MTT formazan (藍(lán)紫色) 干擾素類蛋白：可用細(xì)胞毒抑制試驗(yàn)來(lái)測(cè)定干擾素的體外活性。琥珀

15、酸脫氫酶A 體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定方法琥珀酸脫氫酶五、重要的重組DNA藥物（一）利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽 代表產(chǎn)品：重組人胰島素、重組人生長(zhǎng)激素、重組人干擾素、重組人白細(xì)胞介素、重組人集落刺激因子、重組抗體及其片斷等。 效率高、產(chǎn)量大 周期短、成本低 工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控 缺點(diǎn)是易形成包含體五、重要的重組DNA藥物（一）利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或1）、干擾素（IFN-、） 1957年Isaccs等發(fā)現(xiàn)病毒干擾現(xiàn)象，即病毒感染的細(xì)胞能產(chǎn)生一種因子，作用于其他細(xì)胞干擾病毒復(fù)制，因而命名為干擾素。 根據(jù)產(chǎn)生干擾素細(xì)胞的來(lái)源、理化性質(zhì)和生物活性等差異，可分為、等3種，其中IFN-為多基因產(chǎn)物，

16、有23種以上的亞型。1）、干擾素（IFN-、） 1986年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Roch公司的重組IFN-2a和Schering公司的重組IFN-2b，重組IFN-、分別在1990年和1993年上市。 我國(guó)中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所侯云德等發(fā)現(xiàn)中國(guó)人受病毒攻擊產(chǎn)生的干擾素主要為IFN-1b型，1992年我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物IFN-1b獲得國(guó)家一類新藥證書。 1986年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Roch公司的重組IFN-2a2）胰島素(Insulin, Ins)1921年，Banting FG等從胰臟中分離1955年，Sanger F測(cè)序1965年，我國(guó)完成結(jié)晶牛胰島素全合成1979年，Rutter W等克隆了胰

17、島素基因1982年，第一個(gè)重組人胰島素批準(zhǔn)上市2）胰島素(Insulin, Ins)胰島素的結(jié)構(gòu)及生物合成胰島素原與胰島素人胰島素的生產(chǎn)方法 產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略 胰島素的結(jié)構(gòu)及生物合成重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件(a) AB鏈分別表達(dá)法 體外折疊成功率低，通常只有1020(b) 人胰島素原表達(dá)法 由于C肽的存在，胰島素原在復(fù)性條件下能形成天然的空間構(gòu)象，為三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)提供了良好的條件，使得體外折疊率高達(dá)80以上 目前Ely Lily用這種工藝路線年產(chǎn)幾十噸的重組人胰島素，其經(jīng)濟(jì)效益相當(dāng)可觀。(c) AB鏈同時(shí)表達(dá)法(a) AB鏈分別表達(dá)法 體外折疊成功率低，通常只有10重

18、組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件3）生長(zhǎng)激素1944年，李卓浩等從牛垂體中分離出牛生長(zhǎng)激素1956年，從人垂體中分離出hGH1969年，hGH序列報(bào)道 臨床上用于垂體性侏儒癥。19561985年，只能從人尸體垂體中分離純化。但至1985年，共發(fā)現(xiàn)50多例克-雅氏癥，5人病亡，研究結(jié)果證實(shí)由垂體來(lái)源的生長(zhǎng)激素污染有朊病毒。1985年，垂體來(lái)源的被禁用，同年，rhGH上市。3）生長(zhǎng)激素1985年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)由大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的重組人生長(zhǎng)激素上市，隨后各種途徑生產(chǎn)的重組人生長(zhǎng)激素迅速充斥市場(chǎng)。1997年，僅美國(guó)Genentech和Ely Lily兩家公司的重組人生長(zhǎng)激素年產(chǎn)量已

19、達(dá)20kg，年銷售額超過(guò)3.5億美元。 人生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)重組人生長(zhǎng)激素工程菌的構(gòu)建1985年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)由大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的重組人生長(zhǎng)激素重組DNA藥物醫(yī)學(xué)知識(shí)課件（二）利用重組酵母生產(chǎn)醫(yī)用蛋白優(yōu)勢(shì)：1.最簡(jiǎn)單的真核生物，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理較清楚，并且遺傳操作相對(duì)較為簡(jiǎn)單；2.具有原核無(wú)法比擬的真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)3.不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌在食品工業(yè)當(dāng)中有著幾百年的應(yīng)用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)；4.大規(guī)模發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，成本低廉5.能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中劣勢(shì)：雖然擁有完整的蛋白質(zhì)糖基化修飾系統(tǒng)，但其修飾方式不用于高等真核生物。 舉例：重組

20、乙肝疫苗 重組人血清白蛋白（二）利用重組酵母生產(chǎn)醫(yī)用蛋白優(yōu)勢(shì)：重組HAS的制備人血清白蛋白HAS是血漿中的主要成分 載體蛋白。成熟的人血清白蛋白為一非糖基化的單一多肽鏈，由585個(gè)氨基酸組成，含有17對(duì)二硫鍵，由此維系的空間構(gòu)象是血清白蛋白的生物功能所必需的。 巴斯德畢赤酵母是迄今為止最為優(yōu)良的重組人血清白蛋白的表達(dá)分泌系統(tǒng)。產(chǎn)率可高達(dá)15g/L 重組HAS的制備人血清白蛋白HAS是血漿中的主要成分 載體蛋（三）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞生產(chǎn)生物大分子1.利用動(dòng)物乳腺組織生產(chǎn)蛋白藥物 酪蛋白 、 tPA 、 IL22.利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)復(fù)雜的人體蛋白例如 EPO（三）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞生產(chǎn)生物大分子1.利用動(dòng)物乳腺組織促紅細(xì)胞生成素（EPO） 由腎臟分泌的一種唾液酸蛋白，它能促進(jìn)紅細(xì)胞系的增值、分化和成熟 . 由166個(gè)氨基酸殘基組成的高度糖基化蛋白，其糖基對(duì)其生物活性至關(guān)重要 目前用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如CHO細(xì)胞生產(chǎn)。 臨床為治療腎衰導(dǎo)致貧血的首選藥物，全世界銷售額超過(guò)10億美元。促紅細(xì)胞生成素（EPO）1957年Jacobson等證實(shí)，腎臟是血清EPO的主要來(lái)源，含量極微小，無(wú)法分離純化獲得純品。直到1985年，Jacobs等才先后成功克隆出人、