細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)(一) 2013-11課件

1、細(xì)胞培養(yǎng)實驗技術(shù)韓 紀(jì) 舉泰山醫(yī)學(xué)院動脈粥樣硬化研究所TEL:6223718Email: 1教學(xué)對象及目的：教學(xué)對象包括各科的研究生，教學(xué)任務(wù)由動脈硬化研究所承擔(dān)。教學(xué)目的：通過學(xué)習(xí)，使大家了解細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識，掌握細(xì)胞培養(yǎng)基本的操作技術(shù)及觀察、檢測方法，為今后進(jìn)一步學(xué)習(xí)及科研奠定基礎(chǔ)。2教 學(xué) 要 求：本課程以實驗操作為主。學(xué)員學(xué)習(xí)時應(yīng)在了解基本知識的基礎(chǔ)上，認(rèn)真地按要求進(jìn)行實際操作，以熟練掌握各項實驗操作技術(shù)的原則和要領(lǐng)。3一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識二、細(xì)胞培養(yǎng)的實驗用品及用途三、各種實驗用品的清洗與消毒四、各種液體的配制方法五、細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用范圍六、常用術(shù)語及解釋 七、體外培養(yǎng)細(xì)胞的優(yōu)缺點

2、目 錄4一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識5組織細(xì)胞培養(yǎng)概念細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。習(xí)慣上泛指所有的體外培養(yǎng)，即器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)，和細(xì)胞培養(yǎng)的總稱。 即： 在無菌條件下,從動物(植物也可)或在人體中取出組織或細(xì)胞,置于模擬體內(nèi)的生理環(huán)境中(無菌,適當(dāng)?shù)臏囟群鸵欢ǖ臓I養(yǎng)條件)使之生存和增殖生長的技術(shù)方法。用于研究細(xì)胞、組織的代謝、增殖、分化、形態(tài)和功能變化，各種理化因子對活細(xì)胞的影響。7細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture) 是指用機械或化學(xué)的方法將組織分散成單個細(xì)胞而進(jìn)行的培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)（tissue culture) 是指把活體的組織取出分成小塊，直接置于

3、培養(yǎng)瓶底或通過膠原纖維血漿支持物的培養(yǎng)瓶底來進(jìn)行培養(yǎng)。其特點是：組織不失散，細(xì)胞保持原有的組織關(guān)系。器官培養(yǎng)（organ culture） 是將活體中器官或器官一部分取出，在體外生長、生存，并使其保持器官原有的結(jié)構(gòu)和功能特征的培養(yǎng)。其特點是：培養(yǎng)的器官在合適的條件下能生長和分化，存活數(shù)周或1年。8群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 1011細(xì)胞培養(yǎng)工作者的要求一、掌握操作技術(shù)的同時，尚需明白各種操作的基本原理。二、要有判定細(xì)胞生長好壞和是否發(fā)生污染的能力；三、要熟悉體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件、細(xì)胞的生物學(xué)性狀及與此有關(guān)的基本理論知識。121、體外細(xì)胞的分化特點在個體發(fā)育過程中，子代細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)、結(jié)構(gòu)和

4、功能差異的過程稱為細(xì)胞分化。由于失去了神經(jīng)、激素等體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，經(jīng)多次傳代增殖，久之則發(fā)生如下變化： 分化現(xiàn)象逐漸減弱或不顯，形態(tài)與功能趨于單一化，或傳一定代數(shù)后衰老死亡； 發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲不死性而成為能無限傳代的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。 142、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 上皮細(xì)胞型 貼壁型細(xì)胞 成纖維細(xì)胞型 游走細(xì)胞型懸浮型細(xì)胞 15細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式： (存在差異) 體內(nèi)：粘附是全方位。 外形具有復(fù)雜的立體特征。 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面。 外形一般與體內(nèi)時明顯不同. 171.上皮樣細(xì)胞型僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于體內(nèi)同名的細(xì)胞。來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞

5、如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞。扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞形態(tài)為扁平的多角形，其生長特點為細(xì)胞之間緊密相靠、互相銜接，呈“鋪路石”狀，具有連接成片的能力。 18生長特點： 易相連成片 相靠緊密相連成薄層鋪路石狀 生長時呈膜狀移動 很少脫離細(xì)胞群而單個活動192.成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的細(xì)胞來源：由中胚層間質(zhì)組織起源的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起 中有卵圓形核20生長特點 排列成放射狀，漩渦狀

6、并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨行動 游離的單獨的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起21體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（左）HeLa細(xì)胞（右） 倒置顯微鏡圖223.游走型細(xì)胞(不定型)： 本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。 常見于羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞24貼附生長細(xì)胞的特點1. 與體內(nèi)同名的細(xì)胞不完全相同 如：形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，可不同來源， 自同一動物不同組織的成纖維樣細(xì)胞，形態(tài)相似，但發(fā)展趨向不同。2. 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定 培養(yǎng)條件改變時，細(xì)胞形態(tài)可有變化。25懸浮生長型細(xì)胞概念 培養(yǎng)時不貼附于

7、底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長。來源 血液，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞多見， 癌腫細(xì)胞也可能。特點 在懸浮液中生長良好 細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)。27優(yōu)點 生存空間大，提供數(shù)量大， 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點 觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)懸浮生長型細(xì)胞283、組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程細(xì)胞周期 細(xì)胞培養(yǎng)一代的生長過程 體外培養(yǎng)細(xì)胞的分期 29細(xì) 胞 周 期細(xì)胞周期=G1期+S期+G2期+ M期G1期（DNA合成前期）主要發(fā)生 DNA合成前的有關(guān)生化變化S期（DNA合成期）主要發(fā)生DNA合成G2期（分裂前期）DNA含量加倍，以及

8、RNA的合成和染色質(zhì)的螺旋化M期（分裂期） 主要完成細(xì)胞遺傳物質(zhì)的分配30DNA合成期分裂期DNA合成前期分裂前期31細(xì)胞培養(yǎng)一代的生長過程組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所謂細(xì)胞“一代”一詞，僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。傳代是將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶皿轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)瓶皿內(nèi)生長的過程。 32 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）33游離期： 細(xì)

9、胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱懸浮期。 此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。 34貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘4小時貼壁。 粘附底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等。 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子附著。 進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶多涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)） 35貼附過程 ： 貼附因子粘附 細(xì)胞開始附著 細(xì)胞進(jìn)一步牢固附著伸展36細(xì)胞粘附過程3738影響貼壁的因素1.各種細(xì)胞強弱：巨噬細(xì)胞(附著最強) 成纖維樣細(xì)胞 上皮樣細(xì)胞 血細(xì)胞(最弱)2.生物因素

10、：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子3.機械，物理等因素: 離心：促進(jìn)附著 流動：培養(yǎng)液流動可阻止細(xì)胞附著 低溫：可抑制附著39促進(jìn)細(xì)胞粘附措施1.包被對分化程度高、生長能力差的細(xì)胞，可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和生長的生物活性物質(zhì).如:通過其所帶電荷先吸附, 培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。血清內(nèi)含有多種能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附的成分細(xì)胞本身也可能產(chǎn)生一些粘附分子 2.減少接種時細(xì)胞培養(yǎng)液的量：待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補充足夠的培養(yǎng)液。3.減少培養(yǎng)液中血清的含量，使培養(yǎng)液黏度降低。4.培養(yǎng)液中離子成分及其濃度。如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時不利于細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展。5.培養(yǎng)液的溫度: 低溫會減低細(xì)胞的活動，妨

11、礙黏附和貼壁。 40潛伏期 此時細(xì)胞有生長話動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時。41對數(shù)生長期： 細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。 42停止期（平臺期）： 細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機制：接觸抑制、密度依賴性。（接觸抑制：當(dāng)一個貼壁生長的體外正常細(xì)胞生長至與另一個細(xì)胞的表面相互接觸時，便停止了分裂增殖，相互雖然緊密接觸，但不形成交叉重疊生長，也不進(jìn)入S期。） 密度抑制（density inhibition）：細(xì)胞數(shù)量到一定數(shù)量后引起抑制增殖的現(xiàn)象。43細(xì)胞的接觸抑制44細(xì)胞的生長曲線451.原代培養(yǎng)期2.傳代期3.衰退期體外培養(yǎng)細(xì)胞的分期46原

12、代培養(yǎng)期取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng) 。 原代培養(yǎng)與體內(nèi)原組織很相似，具異質(zhì)性，相互依存性強，細(xì)胞克隆形成率低。此期一般持續(xù)14周。 47傳代期細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中生長（不論稀釋與否） 。持續(xù)時間最長，其特點是細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。衰退期 此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。48原代培養(yǎng)細(xì)胞的流程49原代培養(yǎng)期傳代期衰退期50體外培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要：氨基酸、單糖、維生素、無機離 子、微量元素、激素、生長因子等2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2:

13、5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒51培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 52天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染 53合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物

14、、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低 。 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。 54 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 55血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） 多種金屬離子 激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。 各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分的物質(zhì) 56使用血清的缺點對多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)時，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在傷愈或血凝過程中才可接觸，因此血清的使用有可能改變某種細(xì)胞的狀態(tài)。血清中含有一些有毒性的物質(zhì)，例如：多胺氧化酶，補體，抗

15、體，細(xì)菌毒素等都會影響細(xì)胞的生長，甚至造成細(xì)胞死亡。每批血清之間，成分不能保持一致。取材過程可能帶入支原體、病毒，可能導(dǎo)致實驗失敗或結(jié)果的不可靠。57選擇血清需注意：血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清（剖腹產(chǎn)）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（1030D）、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌58一般說來含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長一般需加 10血清對于血清支持細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)

16、雜成分至今尚未完全清楚血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。59完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位毫升60 無血清培養(yǎng)基在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞61無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定

17、性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。62無血清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補加物也不同。 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清 63抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定 64 PH調(diào)整液NaHCO3溶液：保證培養(yǎng)基在5CO2環(huán)境下PH達(dá)到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)。加量

18、見說明書。HEPES：一種弱酸，羥乙基哌嗪乙硫磺酸，它對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基PH迅速變化?？膳涑?00倍的濃縮液，使用濃度為0.010.05mol/L。65二、實驗用品及用途66超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸。CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管實驗用品：67部分物品的用途壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣。能夠造成蛋白質(zhì)的凝固而使微生物死亡。電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃器皿、金屬器皿的消毒 。濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液

19、等均采用濾過法除菌。 超凈工作臺：為細(xì)胞培養(yǎng)操作提供無菌環(huán)境。紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。能夠破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)而使其滅活（直接作用）。也可利用產(chǎn)生的臭氧 68超凈臺 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 有側(cè)流式、直流式、對流式。69超凈工作臺的工作原理70濾 器717273 CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題： 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋 微松，以保證通氣。 保持培

20、養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。 箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽 中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。7475自動雙重純水蒸餾器 純水儀76酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器77培 養(yǎng) 板78培養(yǎng)瓶 79三、各種實驗用品的清洗與消毒80 常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水） 刷洗（洗潔精） 清潔液泡（不少于 5鹽酸過夜6小時） 流水沖洗 蒸溜水浸泡和沖洗 50烘 注滿水倒空 干 121高壓蒸汽滅菌20min81塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的成品，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用：2% NaOH浸泡過夜 自來水充分沖洗 ，洗潔精洗刷 5%鹽酸溶液浸泡30分鐘 自來水和蒸餾水沖洗（1520

21、遍） 晾干備用 ,紫外線直接照射或輻照滅菌82橡膠制品的清洗每次用后立即置入水中浸泡 沖洗2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘 以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)自來水沖洗 1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘晾干備用注意：橡膠器材需用鋁鉑包裝，放在鋁盒內(nèi)高壓蒸汽滅菌83金屬制品的清洗 洗滌劑刷洗 流水沖洗 去離子水浸泡24小時 三蒸水浸泡24小時 干燥備用8485各種物品的消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培

22、養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。消毒方法分為三類： （A） 物理滅菌法（紫外線、濕熱、過濾等）。 （B） 化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）。 （C） 抗生素。 86紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器 。紫外線燈應(yīng)距地面 已2.0米為宜，且消毒的物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。時間30分鐘。 溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀?，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。常用物品消毒壓力及時間：培養(yǎng)液、橡膠制品、10磅10分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。 過濾消毒：將液體或氣體用微孔慮膜過濾,使大于孔徑的的細(xì)菌等微生物顆粒

23、阻留,達(dá)到除菌的目的.常用于不宜高壓滅菌的物品。如：培養(yǎng)液、各種酶類等。87化學(xué)消毒法：利用消毒劑來消毒那些不能用物理方法消毒的物品和場地。最常見的是75%酒精及1的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。 抗生素消毒：即抗生素滅菌，主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。88不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度壓力（磅）溫度（度）5108.410115.215121.020126.025130.430134.589常用消毒方法及選擇消毒物品壓力蒸汽干熱過濾紫外線化學(xué)氣體化學(xué)消毒劑電力輻射抗生素培養(yǎng)室/工作臺 玻璃制品 金屬器械

24、 塑料制品 橡膠制品 培養(yǎng)用液 棉布類 90無菌室的滅菌： 1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5過氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實驗后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。 91實驗人員的無菌準(zhǔn)備： 1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦凈雙手。 92無菌操作的注意事項： 1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的

25、酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精燈火焰操作。 3.器皿使用前必須過火滅菌4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。 6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。 93四、各種液體的配制94清潔液的配制95清潔液配制的注意事項!配制時注意保護(hù)身體裸露部分及面部的防護(hù)，應(yīng)使用耐酸手套、耐酸圍裙，防止皮膚損傷及燒壞衣服。配制過程中，應(yīng)先將重鉻酸鉀完全溶解于蒸餾水中(必要時可加熱幫助溶解)，然后緩促加入濃硫酸。由于加 入濃硫酸時將產(chǎn)生熱量，因此配制的

26、容器宜用陶瓷或塑料器皿，同時注意散熱、降溫，防止容器破裂，發(fā)生危險。 清潔液配制完畢浸泡器皿時，同樣要注意防止灼傷，應(yīng)輕輕將器皿浸入。浸泡時應(yīng)使器皿內(nèi)部完全充滿清潔液，不留氣泡一般浸泡過夜，或至少為6h以上。96 平衡鹽(BSS)溶液目前最常用的BSS是Hanks液和PBS等。在細(xì)胞培養(yǎng)中，BSS主要有如下用途： （1）作為配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液：如配Eagle培養(yǎng)基。 （2）配制各種試液：如配胰酶消化液。 （3）用于洗滌組織和細(xì)胞97 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2

27、O 1.56 g KH2PO4 0.20 g 加水至1000 ml9899培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2， 加血清（終濃度 10） 100消化液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，溶解及作用的最佳PH是89，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。 胰蛋白酶液消化時

28、間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 101 EDTA液：常用濃度為 002，配制時采用無Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。 胰蛋白酶、EDTA:胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細(xì)胞易脫壁。 膠原酶：適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS或含血清的培養(yǎng)液配制，這樣實驗操作簡便同時提高細(xì)胞成活率。但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。膠原酶的常用劑量為 200 Uml（約為 lmgml）或 003

29、03。最佳PH是6.5。102五、細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用范圍 細(xì)胞培養(yǎng)在病毒學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞作為毒性實驗及安全性實驗的工具103細(xì)胞工程學(xué)研究手段已基本建立遺傳疾病的產(chǎn)前檢查體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)藥物測試在雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用很廣，如基因分離，基因測序與表達(dá)、基因轉(zhuǎn)移與重組，癌基因研究等 104六、常用術(shù)語及解釋 *為國際組織培養(yǎng)協(xié)會對專業(yè)術(shù)語的統(tǒng)一規(guī)定體外培養(yǎng)（in vitro）：原意為在試管中，現(xiàn)常與組織培養(yǎng)一詞通用，譯為體外培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)（tissue culture）：維持組織在體外生長，也泛指體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)（orga

30、n culture）：在體外維持器官、器官的部分或器官的原基生存和生長的方法。105*細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture）：即細(xì)胞（包括單個細(xì)胞）在體外條件下的生長。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞不再形成組織。細(xì)胞融合（cell fusion）：兩個獨立的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞?？捎镁垡叶迹≒EG）或仙臺病毒誘發(fā)。*細(xì)胞雜交（cell hybridization）：兩個或多個不同的細(xì)胞融合。導(dǎo)致一個含核體(aynkaryo）的形成。體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化（in vitro transformation）：細(xì)胞在體外培養(yǎng)中發(fā)生與原細(xì)胞遺傳性狀不同的變化，但不一定具有致癌性。 106單倍體（haploid）：正常細(xì)胞染色

31、體基本數(shù)（每一染色體只有一種）。 整倍體（euploid）：具有兩個以上單倍體數(shù)目的細(xì)胞。非整倍體（aneuploid）：細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)為單倍染色體數(shù)的非整倍數(shù)時稱非整倍體。 二倍體（diploid）：具有兩套染色單體數(shù)目的細(xì)胞（2n）.*原代培養(yǎng)（primary culture）：從體內(nèi)取出細(xì)胞或組織的第一次培養(yǎng)。再培養(yǎng)（subculture）：同傳代。*傳代（passage）也稱再培養(yǎng)無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。也稱再培養(yǎng)。107單層培養(yǎng)（monolayer culture）：培養(yǎng)細(xì)胞在底物上長成單層。 懸浮培養(yǎng)（suspension c

32、ulture）：細(xì)胞在培養(yǎng)液中是懸浮狀態(tài)生長。 *貼壁依賴性（anchorage-dependent）為細(xì)胞需貼附于底物或支持物上才能生長的性質(zhì)。貼壁依賴性細(xì)胞(anchorag dependent cell)：由它們繁衍出來的細(xì)胞（或培養(yǎng)物）只有貼附于不起化學(xué)作用的物體（如玻璃或塑料等無活物體）的表面時，才能生長，生存或維持其功能。108無貼壁性（anchorageindependent）：不依賴于貼附底物或支持物上生長的性質(zhì)。 匯合（confluent）：細(xì)胞相互連接成片占據(jù)所有底物面積。 近匯合（sub-confluent）：細(xì)胞在底物上生長接近，但尚未完全匯合。超匯合（super co

33、nfluent）：單層培養(yǎng)細(xì)胞附在底物上生長，匯合后發(fā)展成多層狀態(tài)。接觸抑制（contact inhibition）：細(xì)胞匯合相互接觸后失去運動的現(xiàn)象。核型（karyotype）：一個細(xì)胞的全部染色體組成和特征。密度抑制（density inhibition）：細(xì)胞數(shù)量到一定數(shù)量后引起抑制增殖的現(xiàn)象。109群體密度（population density）：培養(yǎng)底物單位面積上單層細(xì)胞數(shù)目。飽和密度（saturation density）：在特殊培養(yǎng)條件下，每平方厘米（單層培養(yǎng)）或每毫升細(xì)胞懸液內(nèi)可達(dá)到的最大細(xì)胞數(shù)。*細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系。亞系（sub

34、line）：由原細(xì)胞系分離出的具有與原細(xì)胞系不同性狀的細(xì)胞系。*細(xì)胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱細(xì)胞株。亞株（substrain）：由原細(xì)胞株分離出的具有原株性狀不同的細(xì)胞株。110*細(xì)胞一代時間（cell generation time）：單個細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。代或世代（generation）：細(xì)胞經(jīng)過一次分裂完成的過程；實際應(yīng)用往往指再培養(yǎng)。*群體倍增時間（population doubling time）：在對數(shù)生長期進(jìn)行計算的細(xì)胞增加一倍所需的時間，如從 1 x 106個細(xì)胞增加到 2 x 106

35、個細(xì)胞的時間間隔。 *克隆（clone）：由單個細(xì)胞通過有絲分裂形成的細(xì)胞群體。 克隆形成率（cloning effeciency）：向底物接種單細(xì)胞懸液能形成細(xì)胞小群的百分?jǐn)?shù)。 111接種率（plating efficiency）：再培養(yǎng)細(xì)胞接種時能形成克隆的百分?jǐn)?shù)；如每一克隆均來自單個細(xì)胞對，則與克隆形成率相同。接種存活率（seeding efficiency）接種一定數(shù)量細(xì)胞后，在一定時間內(nèi)，能附于底物上存活的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。二倍體細(xì)胞系或株（dipoid cell line or strain）：具有二倍體核型的細(xì)胞系或株。有限細(xì)胞系（finite cell line）：細(xì)胞系形成后僅能維持有限傳代次數(shù)，最后死亡。連續(xù)或無限細(xì)胞系（continuous cell line or infinite cell line）：具有無限繁殖能力（獲得不死性：immortality）和能反復(fù)進(jìn)行傳代細(xì)胞系。112連續(xù)或無限細(xì)胞株（continuous cell