常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用784

1、第二十二章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application第一頁，共五十二頁。第 一 節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology第二頁，共五十二頁。核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(hete

2、roduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理第三頁，共五十二頁。復(fù)性RNADNA第四頁，共五十二頁。（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù) 探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 第五頁，共五十二頁。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白

3、質(zhì)定性定量及相互作用研究。 第六頁，共五十二頁。 其他斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip)第七頁，共五十二頁。三種印跡技術(shù)的比較第八頁，共五十二頁。分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)?錄第九頁，共五十二頁。放射自顯影照片目 錄第十頁，共五十二頁。DNA點(diǎn)陣目 錄第十一頁，共五十二頁。第 二 節(jié) 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)Polymerase Chain Reaction第十二頁，共五十二頁。5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template

4、 DNA55 555 5 55一、基本工作原理目 錄第十三頁，共五十二頁。Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目 錄第十四頁，共五十二頁。模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR體系基本組成成分第十五頁，共五十二頁。三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C第十六頁，共五十二頁。（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途第十七頁，共五十二頁。三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)

5、錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時PCR技術(shù)第十八頁，共五十二頁。實(shí)時PCR技術(shù)原理目 錄第十九頁，共五十二頁。第 三 節(jié) 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis第二十頁，共五十二頁。核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法 (Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法 (sanger法)第二十一頁，共五十二頁。一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的D

6、NA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。第二十二頁，共五十二頁。二、DNA鏈末端合成終止法第二十三頁，共五十二頁。目 錄第二十四頁，共五十二頁。三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。 第二十五頁，共五十二頁。DNA自動測序結(jié)果舉例目 錄第二十六頁，

7、共五十二頁?；?因 文 庫Gene Library第 四 節(jié)第二十七頁，共五十二頁。基因組DNA文庫 (genomic DNA library)cDNA文庫 (cDNA library) 基因文庫 (gene library)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。第二十八頁，共五十二頁。目 錄第二十九頁，共五十二頁。第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例第三十頁，共五十二頁。疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第 五 節(jié)第三十一頁，共五十二頁。克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性

8、克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候選基因克隆策略(positional candidate gene approaches )第三十二頁，共五十二頁。定義 從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用 生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。第三十三頁，共五十二頁?？寺》绞?利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫； 根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作

9、探針，篩選cDNA文庫。 功能互補(bǔ)試驗(yàn) (functional complementation assay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。 第三十四頁，共五十二頁。（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作 遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析 分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克隆第三十五頁，共五十二頁。（三）非定位候選基因克隆策略 由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因。第三十六頁，

10、共五十二頁。（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。第三十七頁，共五十二頁。第 六 節(jié)遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第三十八頁，共五十二頁。轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。 轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal)目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)第三十九頁，共五十二頁。核轉(zhuǎn)移

11、技術(shù) 即動物整體克隆技術(shù)，將動物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。 二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)第四十頁，共五十二頁。目 錄第四十一頁，共五十二頁?；蛱蕹夹g(shù)也稱基因靶向(gene targeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)第四十二頁，共五十二頁。四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動物模型 單基因決定疾病模型 基因剔除獲得性突變(gain-of-function mutation) 多基因決定疾病模型第四十三頁，共五十二頁。第 七 節(jié) 生 物 芯 片 技 術(shù)Biological Chip Technology第四十

12、四頁，共五十二頁。DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上 。一、基因芯片(gene chip)第四十五頁，共五十二頁。目 錄第四十六頁，共五十二頁。是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)第四十七頁，共五十二頁。第 八 節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) Research Technology of Interaction of Protein第四十八頁，共五十二頁。蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。 蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性第四十九頁，共五十二