消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案

消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案資料僅供參考文件編號：2022年4月消毒劑消毒效力及有效期驗(yàn)證方案版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：消毒劑的選用原則：目的：確認(rèn)各潔凈級別的操作間及設(shè)備外表面按照規(guī)定的消毒程序消毒能夠達(dá)到消毒、防止污染的目的，并在消毒劑有效期內(nèi)能確保其消毒效力能符合要求。范圍：本驗(yàn)證方案適用于本公司潔凈區(qū)的墻面、天花板、門窗、機(jī)器設(shè)備、儀器、操作臺、地漏、推車、桌椅等表面以及操作人員雙手（手套）的消毒等。參考文件《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》《中國藥典》2015版第4部微生物限度檢查法概述本公司的潔凈區(qū)為D級，擬定用于潔凈區(qū)表面消毒的有五種消毒劑：75%乙醇、%新潔爾滅溶液、%新潔爾滅溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液。本次驗(yàn)證方案將選用以上5種消毒劑分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。作用對象一樣的消毒劑每月輪換使用，避免表面微生物產(chǎn)生耐藥菌株。在利用消毒劑進(jìn)行表面擦拭消毒過程中消毒劑的作用時(shí)間應(yīng)不少于10分鐘，利用消毒劑進(jìn)行浸泡消毒的不少于5分鐘。消毒劑的種類、消毒對象、消毒方法和有效期序號名稱消毒對象消毒方法有效期175%乙醇用于設(shè)備表面、器具和手消毒。采用擦拭或噴灑方式密閉保存D級：30天2%新潔爾滅溶液用于地面、墻面、器具、工作服、清潔布、拖布和潔凈鞋的消毒采用擦拭或浸泡方式密閉保存D級：30天3%的新潔爾滅溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存D級：30天4%醋酸氯己定溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存D級：30天5%醋酸氯己定溶液用于工作服、清潔布、拖布和潔凈鞋的消毒采用浸泡方式密閉保存D級：30天為了確認(rèn)消毒劑的消毒效力，通過實(shí)驗(yàn)室考察部分和現(xiàn)場考察部分分別進(jìn)行驗(yàn)證。其中，用定量懸浮試驗(yàn)法和表面實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室考察試驗(yàn)部分。潔凈區(qū)設(shè)施表面材質(zhì)基本都是不銹鋼和玻璃兩種，故表面試驗(yàn)法選用不銹鋼載片和玻璃裁片模擬潔凈區(qū)設(shè)施表面進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。兩種試驗(yàn)方法作用的消毒劑見表。序號試驗(yàn)方法消毒劑1表面實(shí)驗(yàn)法75%乙醇2%新潔爾滅溶液3定量懸浮試驗(yàn)法%的新潔爾滅溶液4%新潔爾滅溶液5%醋酸氯己定溶液6%醋酸氯己定溶液現(xiàn)場考察試驗(yàn)部分選擇車間(D級)的配液間、灌裝間設(shè)備表面消毒前和消毒后分別進(jìn)行取樣，測定其微生物數(shù)量。確認(rèn)前準(zhǔn)備驗(yàn)證用試劑與材料菌種序號名稱序列號1金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]2大腸埃希菌[CMCC(B)44102]3枯草桿菌芽孢[CMCC(B)63501]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]培養(yǎng)基序號名稱備注1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)121℃，20min滅菌備用2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基4胰酪大豆胨培養(yǎng)基5大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW12085）規(guī)格：：55mm，取樣面積為25m26玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)接觸碟（編號：BZW15129）序號消毒劑名稱中和劑備注175%乙醇1%卵磷脂+%聚山梨酯80中和劑經(jīng)121℃，20min滅菌備用。2%新潔爾滅溶液3%的新潔爾滅溶液消毒液擬定選用的中和劑稀釋液%無菌氯化鈉溶液（NS）器具及設(shè)備序號名稱1無菌移液管2錐形瓶3無菌試管4恒溫水浴鍋5恒溫恒濕培養(yǎng)箱6恒溫恒濕培養(yǎng)箱驗(yàn)證用試劑與材料記錄見附錄1。消毒劑消毒效力試驗(yàn)中和劑鑒定試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^該試驗(yàn)，確認(rèn)所用的中和劑對對應(yīng)的消毒劑有良好的中和作用，對試驗(yàn)用菌劑及其恢復(fù)期培養(yǎng)示范有害或不良影響。菌液的制備及計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌工作菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物用％無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1×108~5×108CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1×108~5×108CFU/ml，可不再用％無菌氯化鈉溶液稀釋）。計(jì)數(shù)時(shí)，將1×108~5×108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50～100CFU/ml菌液，并同時(shí)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30～35℃培養(yǎng)2天計(jì)數(shù)。計(jì)算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。白色念珠菌工作菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物用％無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成1×108~5×108CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1×108~5×108CFU/ml，可不再用％無菌氯化鈉溶液稀釋）。計(jì)數(shù)時(shí)，將1×108~5×108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50～100CFU/ml菌液，并同時(shí)采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基23～28℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)。計(jì)算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計(jì)數(shù)結(jié)果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。鑒定試驗(yàn)操作配制75%乙醇、%新潔爾滅溶液、%新潔爾滅溶液、40mg/L的二氧化氯、60mg/L的二氧化氯，具體操作執(zhí)行《清潔劑和消毒劑管理》。將配置好的消毒劑置20℃±1℃恒溫水浴鍋中備用。分組操作試驗(yàn)分組及稀釋操作方法簡表組號混合液A混勻作用10min混合液B混勻作用10min取混合液B或混合液B的稀釋級溶液平板計(jì)數(shù)（2皿/組）取工作菌液加入下列溶液中取混合液A加入下列溶液1消毒劑稀釋液混合液B、10-12消毒劑中和劑混合液B、10-13中和劑稀釋液10-2、10-34中和產(chǎn)物（消毒液與中和劑比例為1:1）稀釋液10-2、0-35稀釋液稀釋液10-2、10-36稀釋液和中和劑各注入無菌平皿中，各制備2皿。具體操作第1組目的：觀察消毒液對試驗(yàn)菌有無殺滅或抑制能力。操作：取消毒劑+工作菌液，混勻作用10min后，取混合液+稀釋液，混勻作用10min，取注皿，平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置23～28℃培養(yǎng)5天計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)。第2組目的：觀察殘留消毒劑被中和后受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否恢復(fù)生長。操作：取消毒劑+工作菌液，混勻作用10min后，取混合液+中和劑，混勻作用10min，用稀釋液稀釋成10-1。分別取未稀釋溶液（混合液+中和劑的混合液）及10-1注皿，各平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于23～28℃培養(yǎng)5天計(jì)數(shù)。第3組目的：觀察中和劑是否有抑菌性操作：取中和劑+工作菌液，混勻作用10min，取混合液l+稀釋液，混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)。第4組目的：觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和殘留消毒劑對試驗(yàn)菌的生長繁殖是否有影響。操作：取消毒劑和中和劑1:1的混合液+工作菌液，混勻作用10min，取混合液l+稀釋液，混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)。第5組目的：作菌落數(shù)對照用操作：取稀釋液+工作菌液，混勻作用10min，取混合液l+稀釋液，混勻作用10min后，用稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應(yīng)稀釋級注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)。第6組目的：作為陰性對照用操作：分別取稀釋液和中和劑各注入無菌平皿中，各制備2皿。結(jié)果判斷試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合下列全部條件，判斷所選中和劑合格。第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長。第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少，且符合下表要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)0〉5x〉(x+5)y〉(y+第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)誤差率不超過15%。計(jì)算公式如下：（3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù)）的絕對值之和誤差率＝————————————————————————×100％3×3組間菌落平均數(shù)第6組無菌生長。否則，說明試劑有污染，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。中和劑鑒定試驗(yàn)記錄見附錄2。定量懸浮試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康挠捎?的新潔爾滅溶液、%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液是通過浸泡或液封消毒，通過定量懸浮試驗(yàn)，確定其消毒效力是否符合要求。試驗(yàn)操作配制%的新潔爾滅溶液、%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液，操作執(zhí)行《清潔劑和消毒劑管理》。將配置好的消毒劑置20℃±1℃恒溫水浴鍋中備用。由于%的新潔爾滅溶液、%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗(yàn)用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗(yàn)用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌。將菌液制備成1×108~5×108CFU/ml的工作菌液，菌液的制備及計(jì)數(shù)同。將試管按需要分組排列在試管架上，試驗(yàn)組分3組（4min、5min、6min各一組），并由左向右逐管標(biāo)明消毒劑、中和劑、10-1、10-2。對照組分1組，并由左向右逐管標(biāo)明稀釋液、中和劑、10-1、10-2、10-3、10-4。。向個(gè)試管加入相應(yīng)的試劑，標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4。加入的稀釋液。吸取工作菌液加入標(biāo)明消毒劑的試管中，對照組加入標(biāo)明稀釋液的試管中，迅速混勻，并開始計(jì)時(shí)。待菌液與消毒劑相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒劑混合液，加入標(biāo)明中和劑的試管中，迅速混勻。中和作用10min后，吸取加入標(biāo)明10-1的試管中，混勻后吸取加入標(biāo)明10-2試管中（對照組以此類推，對照組直至10-4）。試驗(yàn)組分別取中和劑管、10-1、10-2管溶液1ml按平皿法測定存活菌數(shù)；對照組取10-3、10-41ml按平皿法測定存活菌數(shù)。每管平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于23～28℃培養(yǎng)5天計(jì)數(shù)。結(jié)果計(jì)算計(jì)算試驗(yàn)組和對照組的活菌濃度

（CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并按下式計(jì)算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值

(KL)＝對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）－試驗(yàn)組活菌濃度對數(shù)值（NX）可接受標(biāo)準(zhǔn)殺滅對數(shù)值

(KL)應(yīng)不低于3~5個(gè)對數(shù)單位。定量懸浮試驗(yàn)記錄見附錄3表面試驗(yàn)法試驗(yàn)?zāi)康挠捎?5%乙醇、40mg/L二氧化氯溶液、%新潔爾滅溶液是通過擦拭消毒，故選用不銹鋼載片和玻璃裁片進(jìn)行表面試驗(yàn)法，確定其消毒效力是否符合要求。菌種選擇由于75%乙醇、%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗(yàn)用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液為高效消毒劑，能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗(yàn)用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌。工作菌液制備工作菌液的制備方法、濃度及驗(yàn)證同步計(jì)數(shù)操作同。試驗(yàn)操作染菌不銹鋼載片制備將經(jīng)滅菌的載片平鋪于無菌平皿內(nèi)，滴加金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌含菌量為1×108~5×108CFU的菌液，并均勻涂布于整個(gè)載體表面。滴染菌液后，載片置超凈工作臺晾干后備用。每種菌平行制備兩個(gè)染菌不銹鋼載片。（2）染菌玻璃載片制備因培養(yǎng)皿的材質(zhì)為玻璃，故用培養(yǎng)皿代替玻璃載片進(jìn)行染菌試驗(yàn)。進(jìn)行菌液滴染前，用記號筆在培養(yǎng)皿菌液滴染面的背面畫出染菌面積（50mm×50mm），標(biāo)注清晰。菌液滴染操作同染菌不銹鋼載片制備。試驗(yàn)組：將消毒劑擦拭在制備好的染菌載片上，消毒劑作用時(shí)間分別為8min、10min、12min，不銹鋼載片和玻璃載片每個(gè)作用時(shí)間分別制備2個(gè)。作用結(jié)束后，用接觸碟取樣（接觸碟規(guī)格：55mm，取樣面積為25m2）。取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW12085）；取樣白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW15129）。接觸碟取樣方法：打開接觸碟蓋，使無菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣面表面均勻接觸10秒左右，在蓋上跌蓋。對照組對照組的活菌濃度計(jì)數(shù)見。.陰性對照：用接觸碟在已滅菌的載片上（未染菌片的載）按壓取樣，操作同上。每種載片及每種接觸碟平行制備兩份。培養(yǎng)將取樣金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌的接觸碟倒置于30～35℃培養(yǎng)3天計(jì)數(shù)；取樣白色念珠菌的接觸碟倒置于23～28℃培養(yǎng)5天計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)。結(jié)果計(jì)算計(jì)算試驗(yàn)組和對照組的活菌濃度

（CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并按下式計(jì)算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值

(KL)＝對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）－試驗(yàn)組活菌濃度對數(shù)值（NX）可接受標(biāo)準(zhǔn)殺滅對數(shù)值

(KL)應(yīng)不低于3~5個(gè)對數(shù)單位。表面試驗(yàn)法記錄見附錄5現(xiàn)場考察試驗(yàn)消毒前對潔凈區(qū)進(jìn)行表面微生物取樣。取樣地點(diǎn)：D級車間的配料間墻壁和設(shè)備表面、灌裝間墻壁和設(shè)備表面、中間站墻壁表面。取樣操作及檢驗(yàn)執(zhí)行《表面微生物檢驗(yàn)》。生產(chǎn)操作結(jié)束后操作人員按照《生產(chǎn)區(qū)清