南方醫(yī)大癌生物學(xué)講義06-1酪氨酸磷酸化的調(diào)控作用

第六章（1）酪氨酸磷酸化的調(diào)控作用前言：在上一章的學(xué)習(xí)中，我們提到了Src和EGFR的酪氨酸激酶功能，但是對于酪氨酸磷酸化的具體調(diào)控功能沒有展開深入的講解。今天，我們主要的學(xué)習(xí)內(nèi)容就是：酪氨酸磷酸化調(diào)控胞內(nèi)蛋白質(zhì)信號的定位和功能。哈哈，要講到各種信號分子間的相互調(diào)控啦，一聽就不是好惹的“家伙”呢。先打個預(yù)防針，這一章節(jié)的內(nèi)容可能是整本書最有挑戰(zhàn)性的一章了。因此，各種字眼，每個句子的意思，大家可要花費一番不小的心思去琢磨呢。雖然比較難啃，但是估計也是各位同學(xué)最想啃下來的部分了，要加油哦~從細(xì)胞表面至細(xì)胞核的信號通路01暴露于有絲分裂原的細(xì)胞，其生長和分裂的改變包含著成千上萬種胞內(nèi)蛋白的協(xié)同作用。那么，生長因子是結(jié)合并激活它們的受體后發(fā)生了什么改變呢？對于這些問題的認(rèn)識的重要進展來自于1981年的實驗，即利用撤除生長因子的血清培養(yǎng)正常細(xì)胞（使用正常成纖維細(xì)胞）的實驗。在“血清饑餓”期間，培養(yǎng)的細(xì)胞都可逆地進入了不生長的靜止?fàn)顟B(tài)，稱為G0期。處于G0期幾天后，“血清饑餓”的細(xì)胞又被置于含有新鮮血清中獲得充足的有絲分裂生長因子。此實驗的目的是將所有的培養(yǎng)細(xì)胞都誘導(dǎo)至一個活躍生長和分裂同步的狀態(tài)。的確，經(jīng)過9~12h后，這些原先靜止的細(xì)胞大多數(shù)開始了DNA的復(fù)制，幾小時后又開始了細(xì)胞分裂。在不到1h的時間內(nèi)，100多種胞內(nèi)基因即被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。這些基因表達(dá)被我們稱為即刻早期基因

(IEG)的表達(dá)，在生長因子剌激不到半小時內(nèi)就迅速增加。1981年實驗的另一個衍生實驗，是用新鮮血清和放線菌酮一起處理細(xì)胞。放線菌酮是一種能阻斷所有胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)。盡管抑制了蛋白質(zhì)合成，即刻早期基因的誘導(dǎo)依然正常進行。這表明在血清加入細(xì)胞的時候，激活即刻早期基因的轉(zhuǎn)錄所需要的蛋白質(zhì)就已經(jīng)就位了。換句話說，這些基因的誘導(dǎo)不需要蛋白質(zhì)的從頭合成。在即刻早期基因mRNA誘導(dǎo)1h內(nèi)，第二輪基因誘導(dǎo)表達(dá)開始了。這些延遲早期基因的誘導(dǎo)表達(dá)會被放線菌酮有效阻斷，表明它們的表達(dá)依賴于蛋白質(zhì)的從頭合成（實際上，這些延遲早期基因的表達(dá)似乎依賴于即刻早期基因表達(dá)出來的轉(zhuǎn)錄因子）。圖1:即刻早期基因與延遲早期基因即刻早期基因編碼一些有趣的蛋白質(zhì)。其中一些是轉(zhuǎn)錄因子，它們一旦被合成，就能誘導(dǎo)下一輪基因的表達(dá)，包含myc、fas和jun等最初鑒定的與逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因。其他即刻早期基因則編碼分泌型細(xì)胞因子(cytokine),或者編碼細(xì)胞骨架蛋白。給靜止細(xì)胞添加生長因子除了能迅速誘導(dǎo)核內(nèi)基因表達(dá)外，還能引起細(xì)胞生理上的其他變化。靜止細(xì)胞暴露于血清后，通過活化一些具有促核糖體起始mRNA功能翻譯的蛋白質(zhì)，使胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成速率顯著增加。一些生長因子可以誘導(dǎo)細(xì)胞運動，表現(xiàn)為沿培養(yǎng)皿的底層移動。其他一些生長因子可以引起決定細(xì)胞形態(tài)的平滑肌肌動蛋白纖維的重組，來協(xié)助構(gòu)建細(xì)胞骨架——這是決定細(xì)胞形態(tài)的支架。還有許多生長因子為細(xì)胞存活提供信號，保護細(xì)胞不會激活一些不利于細(xì)胞生存的反應(yīng)，如細(xì)胞亡之類的自殺程序。這些形形色色的反應(yīng)表明配體激活生長因子受體后，可發(fā)散出一系列不同的生化信號，并且這些信號作用于胞內(nèi)的不同靶點，代表著這背后肯定有著紛繁復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的故事從Ras蛋白說起02細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路慢慢地像一個游戲拼圖那樣被拼湊起來，其中的故事要從Ras蛋白開始。在上一章中我們討論過Ras的特點，但并沒有表明它是如何與整個信號網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來的。故事起源于研究者發(fā)現(xiàn)一個被稱為Sevenless的基因?qū)M成果蠅復(fù)眼的光感原件小眼的正常發(fā)育起關(guān)鍵作用。Sevenless基因編碼的蛋白質(zhì)含有酪氨酸激酶受體普遍存在的結(jié)構(gòu)，即哺乳動物的成纖維細(xì)胞生長因子受體。一個名為Sonofsevenless簡稱sos的基因編碼其中一個下游蛋白，并發(fā)現(xiàn)Sos蛋白與參與激活核苷酸交換的G蛋白如Ras有關(guān)。這些酵母蛋白，通常被稱為鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF),可通過誘導(dǎo)G蛋白釋放GDP,以便為GTP的結(jié)合提供位點。這樣便可將這些G蛋白從無活性狀態(tài)誘導(dǎo)為活化的、可釋放信號的構(gòu)象。而這個精細(xì)的反應(yīng)是Sos作用于Ras之后的結(jié)果。因此，Sos就是長期以來尋找的可將Ras轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)的上游刺激因子，是調(diào)控Ras的關(guān)鍵組分。圖2：Sos蛋白隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了信號級聯(lián)中的其他中間分子。其中的兩個是Shc和Grb2。這些蛋白質(zhì)的功能是作為接頭蛋白，在生長因子受體和Sos之間起橋連作用。第三個此類的接頭蛋白稱為Crk,是一種由CT10鳥肉瘤病毒編碼的癌蛋白。以上這些結(jié)果提示人們有這樣一條線性信號級聯(lián)：酪氨酸激酶受體→Shc→Grb→Sos→Ras。但這些級聯(lián)只給出了一條信號通路的框架，并未在相互作用的生化方式上說明各種蛋白質(zhì)間是如何傳遞信號的。酪氨酸磷酸化的調(diào)控作用03那么生長因子受體上的酪氨酸殘基的磷酸化是怎樣向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的呢？就像我們知道了這條信號級聯(lián)：酪氨酸激酶受體→Shc→Grb→Sos→Ras，他們的信號又是怎樣一步步傳遞下去的呢？通過對Src蛋白結(jié)構(gòu)的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了3種不同的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域，每一種都既存在于Src蛋白中，又存在于其他的無關(guān)蛋白質(zhì)中。這些序列被稱為Src的同源結(jié)構(gòu)域l、2、3(SH1、SH2、SH3)。這對于解開受體信號通路這個謎題起到了關(guān)鍵的作用。圖3：Src蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)我們來仔細(xì)看看這三種結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能——SH1結(jié)構(gòu)域Src蛋白的SH1結(jié)構(gòu)域代表它的催化結(jié)構(gòu)域，并且和Src構(gòu)型相似的所有受體酪氨酸激酶和非受體酪氨酸激酶中都存在相似的結(jié)構(gòu)域。如圖3所示，SH1的催化結(jié)構(gòu)包含兩部分——N端和C端激酶結(jié)構(gòu)域（黃色和橙色）。ATP的結(jié)合位點就位于這兩個末端之間（紅色棒）。ATP是細(xì)胞的萬能磷酸根供者。SH2結(jié)構(gòu)域SH2結(jié)構(gòu)域的功能是作為內(nèi)部的“受體”發(fā)揮作用，即識別胞質(zhì)中的底物。它既能識別磷酸化酪氨酸，又能識別磷酸化酪氨酸C端的側(cè)翼氨基酸序列。而正是這些側(cè)翼氨基酸殘基保證了結(jié)合的特異性。一個SH2結(jié)構(gòu)域可使攜帶它的蛋白質(zhì)與一個伴侶蛋白結(jié)合，這個伴侶蛋白具有特異的磷酸化酪氨酸及側(cè)翼氨基酸序列，從而使這兩種蛋白質(zhì)發(fā)生物理結(jié)合。一些含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)并不只有催化活性，而其他一些這類蛋白質(zhì)，除了具有SH2結(jié)構(gòu)域，還攜帶與Src蛋白本身的酪氨酸激酶活性完全不同的催化點。例如，SHP1蛋白則攜帶與一個磷酸酶的催化結(jié)構(gòu)域連接的一個SH2結(jié)構(gòu)域，該磷酸酶結(jié)構(gòu)域具有去磷酸化活性，可以對抗激酶的磷酸化作用。圖4：SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能SH2結(jié)構(gòu)域的相關(guān)發(fā)現(xiàn)最終回答了酪氨酸激酶受體是如何發(fā)出信號的問題。正如上一章講到的，配體誘導(dǎo)的受體轉(zhuǎn)磷酸作用的結(jié)果是受體分子（如血小板衍生的生長因子

β

受體等）胞內(nèi)區(qū)產(chǎn)生特征性的磷酸酪氨酸殘基譜；同樣，表皮生長因子受體的胞內(nèi)區(qū)也具有特異的磷酸化酪氨酸。這些磷酸酪氨酸殘基（其C端的氨基酸序列決定了其特異性）對各種含SH2的胞內(nèi)蛋白質(zhì)具有親和力，尤其是胞質(zhì)內(nèi)可溶區(qū)（細(xì)胞液）的一些常見蛋白質(zhì)。于是，在被配體結(jié)合激活后不久，一個生長因子受體就被一系列伴侶蛋白——通過SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合到其磷酸化酪氨酸殘基上所修飾。（多讀幾遍，好好理解理解這段話，這是本篇推文最核心的知識點）例如，配體激活的血小板來源生長因子受體可以募集Src、PI2K、Ras-GAP（可激活Ras的GTP酶活性）、SHP2（含SH2的酪氨酸磷酸酶2)和PLC-γ

（磷脂酶C-γ），這些蛋白質(zhì)都攜帶至少一個SH2結(jié)構(gòu)域。當(dāng)血小板來源的生長因子受體的胞內(nèi)尾部和激酶區(qū)（稱為“激酶插入?yún)^(qū)")中間很短的一段酪氨酸磷酸化后，這些蛋白大量結(jié)合到血小板來源生長因子受體上。一旦定位于PDGF受體上，一些含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白就成為PDGF受體激酶的酪氨酸磷酸化底物。每一種蛋白質(zhì)都控制著自身下游的信號級聯(lián)，而每種級聯(lián)都影響不同方面的細(xì)胞行為。含SH2蛋白質(zhì)與受體分子結(jié)合后就會激活它們相應(yīng)的信號級聯(lián)。一些含有SH2的蛋白質(zhì)可以激活負(fù)反饋環(huán)并最終關(guān)閉受體信號通路。這就解釋了一個生長因子是如何激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生不同生物化學(xué)和生物學(xué)反應(yīng)的。圖5：磷酸化受體募集的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白由于酪氨酸激酶受體胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域位于質(zhì)膜內(nèi)表面，由受體募集而來的含SH2蛋白也就貼近質(zhì)膜，即由于各種原因已存在質(zhì)膜上的其他蛋白質(zhì)。這種靠近使得各種含SH2蛋白可直接與質(zhì)膜相關(guān)蛋白或磷脂相互作用，故而產(chǎn)生一系列生化信號，并通過各種信號級聯(lián)傳遞下去。其中最經(jīng)典的例子就是Ras調(diào)控的信號通路，將會在下一期中進行詳細(xì)敘述。SH3結(jié)構(gòu)域SH3結(jié)構(gòu)域是Src蛋白中的第三個序列模板，其功能是調(diào)節(jié)催化的活性。它能特異地結(jié)合伴侶蛋白中的富含脯氨酸序列結(jié)構(gòu)域，這些富含脯氨酸的序列就作為SH3結(jié)構(gòu)域配體來發(fā)揮作用。在Src蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域這個例子中，有證據(jù)表明這個結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合特定的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的底物，這些底物一旦與Src結(jié)合，可被Src的激酶活性磷酸化。其他證據(jù)則指出，Src蛋白本身就含有富含脯氨酸的連接結(jié)構(gòu)域，可以與其自身的SH3結(jié)構(gòu)域相連，形成分子內(nèi)連接，Src蛋白激酶的功能即被沉默。最后，我們再返回去看一下這條級聯(lián)通路就會比較清楚了：酪氨酸激酶受體→Shc→Grb→Sos→Ras。Grb2蛋白包含兩個SH3結(jié)構(gòu)域和一個SH2結(jié)構(gòu)域。它的SH3結(jié)構(gòu)域?qū)os中兩個不同的富含脯氨酸序列具有親和能力，而它的SH2結(jié)構(gòu)域則可與眾多生長因子激活受體的C端的磷酸化酪氨酸結(jié)合。對Grb2蛋白及與其構(gòu)象相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（如Crk)進行深入分析表明，它們除了SH2和SH3結(jié)構(gòu)域之外并不攜帶其他功能結(jié)構(gòu)域。顯然，這些接頭蛋白的作用就是把不同的蛋白質(zhì)連接起來（下圖中還顯示了另一種橋連形式，即一個生長因子受體通過Grb2或Shc與Sos連接時所采用的方式）