氨基酸測定方法

光度分析法[5][6]-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的條件下可以生成藍(lán)紫色物質(zhì)[7]，其顏色深淺主要與β-氨基丙酸的濃度有關(guān)。因此可利用此顯色反應(yīng)采用比色法定量測量β-氨基丙酸。我在實驗中發(fā)現(xiàn)很多因素如濃度、pH值、反應(yīng)溫度、以及反應(yīng)時間等對此顯色反應(yīng)有很大的影響。如忽視這些因素會使實驗產(chǎn)生很大的誤差。就此顯色反應(yīng)的最佳條件我做了初步的探究。試劑的配制：緩沖液的配制：配制 pH=的NaAc－HAc緩沖溶液β-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用電子天平準(zhǔn)確稱取gβ-氨基丙酸(生化純)，溶于250mlpH=緩沖溶液中，得到C=g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。茚三酮試劑的配制：稱取茚三酮溶于100ml蒸餾水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定分別準(zhǔn)確移取、、、、、、、標(biāo)準(zhǔn)液于8個比色管中，用pH=的緩沖溶液稀釋到再加入1ml茚三酮水溶液充分搖勻，將其放在沸水浴中加熱10min。冷卻到室溫，用7230型分光光度計在569nm下測其吸光度。以吸光度和濃度作一個標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測定稀釋待測液于ml—ml,調(diào)pH值到，以相同的反應(yīng)條件，測其吸光值并與上面的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照查出稀釋液的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為β-氨基丙酸的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果β-氨基丙酸濃度在 ml—ml范圍內(nèi)與茚三酮水溶液反應(yīng)，顏色表現(xiàn)出由淺藍(lán)到深藍(lán)的遞增變化。用茚三酮比色法測得的一組數(shù)據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1：B1.41.21.0度光0.8吸0.60.40.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1加入標(biāo) 液體積(ml)圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定Fig1Determinationofthestandardcurve注：在沸水中加熱 10min，β-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 5ml、茚三酮水溶液 1ml、緩沖溶液pH=樣品的測定分析將待測的一批稀釋 50倍，母液稀釋的程度可以根據(jù)以與標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同的反應(yīng)條件下反應(yīng)，再觀察樣品的顯色程度而確定。 取稀釋后的產(chǎn)物液 1ml,用pH=的緩沖液稀釋到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加熱10min,測得如下數(shù)據(jù)如表3：表3 樣品的測定Table3Determinationofsample待測液序號待測液所對吸光度A應(yīng)的反應(yīng)時間110h220h322h濃度對顯色反應(yīng)的影響 :實驗表明，β-氨基丙酸與茚三酮水溶液在表3所注的條件反應(yīng)的最低濃度為ml，隨著β-氨基丙酸的濃度變大顯色逐漸變深。當(dāng)濃度大于ml時，所顯顏色過深或生成紫色化合物影響其吸光度。當(dāng)β-氨基丙酸的濃度在m—ml時，顏色變化明顯而且穩(wěn)定，因此，我選定此濃度范圍作為測定范圍。得到的數(shù)據(jù)如表 4：表4 濃度對顯色反應(yīng)的影響Table4 Concentrationonthecolorreaction標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mg/ml)顏色變基本淺藍(lán)

藍(lán)

深藍(lán)

藍(lán)紫化 無色吸光度A注：在沸水中加熱 10min，標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為 5ml,加入1ml茚三酮水溶液。pH值對顯色反應(yīng)的影響[8]以ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加熱10min,觀察到的顏色變化如表5：表5pH值對顯色反應(yīng)的影響Table5TheinfluenceofpHonthecolorreactionpH值顏色

無色

淺藍(lán)

淺藍(lán)

藍(lán)

藍(lán) 深藍(lán)

紅棕紅棕紅棕色色色注：在沸水中加熱10min，β-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、緩沖溶液Ph=顯色反應(yīng)隨著pH值得不同，顏色有著明顯的變化。當(dāng)pH值小于時幾乎無色，而在pH值在—時顏色變化明顯。pH值為，加熱不到二分鐘即顯色；pH值為，加入茚三酮溶液后不加熱30s左右即顯紅棕色；茚三酮水溶液在強堿的條件下帶有明顯的淡黃色。因此pH值為左右最好。故我選定pH值為。此時顯色明顯無干擾且穩(wěn)定。溫度和反應(yīng)時間的影響：實驗表明：溫度和反應(yīng)時間對此顯色反應(yīng)的影響很大。溫度太低，反應(yīng)太慢導(dǎo)致顯色時間長，而且顯色效果不好。而溫度過高，反應(yīng)時間長對此反應(yīng)影響也很大，會生成紫色化合物影響其吸光度。在顯色反應(yīng)中，反應(yīng)時間主要根據(jù)具體的顏色變化而定。一般來說，β-氨基丙酸濃度在ml—ml時，在沸水中加熱10min即可，時間太短，反映不完全顏色梯度不明顯。時間過長，溶液揮發(fā)嚴(yán)重也影響其吸光度。故我把反應(yīng)時間定在10min左右。其他因素的影響不同溶劑的茚三酮溶液對顯色反應(yīng)也有一些影響。為了區(qū)別它們對顯色反應(yīng)的影響，我做了如下實驗：分別稱取茚三酮三份，分別溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以觀察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取β-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液l)1ml三份,用pH值為的NaAc－HAc緩沖溶液稀釋到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加熱。實驗表明：在加熱2min時，乙醇溶液開始顯色；丙酮溶液的顯紅棕色；水溶液無色。在加熱6min時，丙酮溶液的顏色加深；水溶液顯淺藍(lán)色；乙醇溶液的所顯顏色最深。乙醇易揮發(fā)，在加熱的條件下?lián)]發(fā)更嚴(yán)重?；谶@一點的考慮，我采用茚三酮水溶液。而茚三酮的用量對此顯色反應(yīng)的影響不大，可以選擇5ml的被測液與1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反應(yīng)。測定時，最好選擇標(biāo)樣與待測液在同一水浴。這樣可以減少誤差提高測定的準(zhǔn)確度。另外，當(dāng)被測液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，影響測定結(jié)果?？傊崛壬ㄗ鳛橐环Nβ-氨基丙酸的定量檢測方法具有操作簡單、成本低的優(yōu)點。只要控制好反應(yīng)條件就能得到較好的測量結(jié)果。三．茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定 pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成蘭紫色化合物?？梢杂帽壬ǘ繙y定。試劑：1）磷酸緩沖液（）制備方法如下：稱磷酸二氫鉀。定容500ml稱NAH2PO4·12H2O分別溶解定容500ml取磷酸二氫鉀 10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為的緩沖液（2）2%茚三酮溶液：稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫（SnCl2·H2O）攪拌過濾（作防腐劑）→于冷暗處過夜→定容 50ml①氨基酸標(biāo)液稱干燥氨基酸（如異亮氨酸）→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml標(biāo)液3操作方法：（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取7個25ml容量瓶，吸取標(biāo)液 0至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各

于7個25ml容量瓶，加水補充1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測定：取樣品~（液體樣5-10ml）→于燒杯中→加 50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量（Ug）W——測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g）注意事項：茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置 30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶，過濾，用

2ml

冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。茚三酮顯色法測定氨基酸含量一、目的學(xué)習(xí)茚三酮顯色法測定氨基酸含量的方法二、原理茚三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。氨與茚三酮和還原性茚三酮反應(yīng)，生成紫色化合物。該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過測定 570n處的光密度，測定氨基酸的含量。三、試劑與材料1）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：配制成L溶液。2），2mol/L醋酸緩沖液：量取86mL2mol/L醋酸鈉溶液，加入14mL2mol/L乙酸混合而成。用pH檢查校正。3）茚三酮顯色液：稱取85mg茚三酮和15mg還原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。茚三酮若變?yōu)槲⒓t色，則需按下法重結(jié)晶：稱取5g茚三酮溶于15～25mL熱蒸餾水中，加入活性炭，輕輕攪拌。加熱30min后趁熱過濾，濾液放入冰箱過夜。次日析出黃白色結(jié)晶，抽濾，用1mL冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器干燥后，裝入棕色玻璃瓶保存。還原型茚三酮按下法制備：稱取5g茚三酮，用125mL沸蒸餾水溶解，得黃色溶液。將5g維生素C用250mL溫蒸餾水溶解，一邊攪拌一邊將維生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不斷出現(xiàn)沉淀。滴定后繼續(xù)攪拌15min，然后在冰箱內(nèi)冷卻到4℃，過濾、沉淀用冷水洗滌3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，備用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去過氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亞鐵，振蕩1～2h，過濾除去硫酸亞鐵，再經(jīng)蒸餾，收集沸點為121～125℃的餾分，為無色透明的乙二醇甲醚。4）60％乙醇。5）樣品液：每毫升含～50μg氨基酸。6）分光光度計。7）水浴鍋。四、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別取L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液 0，，，，，于試管中，用水補足至 1mL。各加入1mL，2mol/L醋酸緩沖液；再加入1mL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100℃水浴中加熱15min，用自來水冷卻。放置5min后，加入3mL60％乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計測定OD570nm。（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，應(yīng)測定OD440nm）。以O(shè)D570nm為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)