雙表達(dá)系統(tǒng)制備新型冠狀病毒N基因裝甲R(shí)NA顆粒的研究

雙表達(dá)系統(tǒng)制備新型冠狀病毒N基因

裝甲R(shí)NA顆粒的研究摘要人工合成新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)標(biāo)準(zhǔn)參考毒株Wuhan/WIV04/2019完整N基因序列(1260bp)和包含MS2噬菌體基因組成熟酶蛋白、衣殼蛋白基因序列(1682bp),分別克隆到原核雙表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1的2個(gè)不同的多克隆位點(diǎn)，從而獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pACYC-MS2-CoV2N。將pACYC-MS2-CoV2N轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得含有SARS-CoV-2完整N基因的裝甲R(shí)NA顆粒。經(jīng)鑒定裝甲R(shí)NA顆粒含有SARS-CoV-2完整N基因且沒有DNA殘留，并可抵抗RNase消化。采用熒光RT-PCR對(duì)裝甲R(shí)NA顆粒進(jìn)行定值后，制備出了用于SARS-CoV-2N基因檢測(cè)的核酸質(zhì)控品，該核酸質(zhì)控品均勻、穩(wěn)定、可重復(fù)性好，在2?8。?？杀４?80d，可用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的質(zhì)控。關(guān)鍵詞雙表達(dá)系統(tǒng)；新型冠狀病毒；N基因；裝甲R(shí)NA顆粒PreparationofSARS-CoV-2NGeneArmoredRNA

ParticlesbyDualExpressionSystemAbstractThecompleteNgenesequence(1260bp)ofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus2(SARS-CoV-2)referencestrainWuhan/WIV04/2019andtheMS2phagegenomematureproteinandcapsidproteingenesequence(1682bp)wereclonedintotwodifferentmultiplecloningsitesoftheprokaryoticdualexpressionplasmidpACYCDuet-1respectively.TherecombinantexpressionplasmidpACYC-MS2-CoV2NobtainedwastransformedintoE.colistrainBL21(DE3).Afterexpressionandpurification,theresultingarmoredRNAparticleswereshowntocontaincompleteNgeneofSARS-CoV-2withoutDNAresidueandberesistanttoRNasedigestion.TheNgenenucleicacidcontrolsfortestingofSARS-CoV-2werepreparedbasedonthequantitationofarmoredRNAparticlesbyreal-timeRT-PCR.Thenucleicacidcontrolswereuniformandstable,andcouldbestoredat2?8°Cfor180days.ItcouldbeusedforqualitycontrolofnucleicacidtestingofSARS-CoV-2withgoodrepeatability.Keywordsdualexpressionsystem;severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2;Ngene;armoredRNAparticles新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)可通過飛沫和接觸引起人際傳播，引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)，無癥狀感染者不表現(xiàn)出任何癥狀，輕癥感染者可表現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽，重癥患者發(fā)病后出現(xiàn)呼吸困難，進(jìn)而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，可導(dǎo)致多器官功能衰竭［1］。由于SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)，因此使用快捷、精準(zhǔn)的方法及時(shí)檢出傳染源并采取措施切斷傳播鏈?zhǔn)且咔榉揽氐年P(guān)鍵。核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)是目前用于SARS-CoV-2快檢的主要技術(shù)手段。國內(nèi)外針對(duì)SARS-CoV-2的保守基因建立了多種核酸檢測(cè)方法，其中應(yīng)用最多的是熒光RT-PCR方法。目前常見的靶標(biāo)序列包括非結(jié)構(gòu)基因ORF1和結(jié)構(gòu)基因，其中非結(jié)構(gòu)基因一般選擇nsp-12(RdRp)、nsp-13(Helicase)以及ORF1的其他基因區(qū)域，而結(jié)構(gòu)基因常選擇E基因和N基因。對(duì)于SARS-CoV-2，N基因兼具特異性和保守性，因此幾乎所有商品化檢測(cè)試劑的檢測(cè)靶標(biāo)均包含N基因［2-4］。使用核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行病毒檢測(cè)時(shí)，安全、穩(wěn)定的質(zhì)控品是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵因素。本文使用裝甲R(shí)NA技術(shù)，并采用了增加pac位點(diǎn)的數(shù)量和親和力的策略［5-6］，利用單質(zhì)粒雙表達(dá)系統(tǒng)將MS2噬菌體衣殼蛋白和成熟酶的序列以及SARS-CoV-2完整N基因(首尾均添加C-突變體pac位點(diǎn)序列)分別克隆到載體的2個(gè)多克隆位點(diǎn)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)研制出包裹SARS-CoV-2完整N基因的裝甲R(shí)NA顆粒。該病毒顆粒穩(wěn)定性好，可抵抗核酸酶的降解作用，且無生物危害性，可作為SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的陽性對(duì)照和質(zhì)控品，對(duì)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)進(jìn)行質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)估。1材料和方法1.1供試表達(dá)載體、菌株、包含新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)標(biāo)準(zhǔn)參考毒株SARS-CoV-2/Wuhan/WIV04/2019完整N基因序列和MS2噬菌體成熟酶蛋白、衣殼蛋白基因序列的克隆載體表達(dá)載體pACYCDuet-1由本實(shí)驗(yàn)室保存；ToplO、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化有限公司。新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)標(biāo)準(zhǔn)參考毒株SARS-CoV-2/Wuhan/WIV04/2019完整N基因(1260bp)，包含MS2噬菌體基因組成熟酶蛋白、衣殼蛋白基因序列(1682bp)均由上海生工合成，并克隆于pBluscriptIISK(+)載體，分別命名為pBSK-CoV-2N和pBSK-MS2。1.2主要試劑M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7試劑盒購自Promega公司；DNA片段純化試劑盒、HSTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNaseI、RNaseA、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；SephacrylS-200購自Sigma公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司。1.3引物設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank中登錄的pMS27噬菌體基因序列和新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)標(biāo)準(zhǔn)參考毒株SARS-CoV-2/Wuhan/WIV04/2019序列重新設(shè)計(jì)引物，從合成質(zhì)粒pBSK-MS2和pBSK-CoV-2N擴(kuò)增目的基因并分別克隆于pACYCDuet-1的2個(gè)多克隆位點(diǎn)。其中，編碼MS2成熟酶和衣殼蛋白基因的片段擴(kuò)增長(zhǎng)度為1682bp；編碼SARS-CoV-2完整N基因擴(kuò)增片段為1321bp(含C-突變體pac

位點(diǎn)序列）。同時(shí)合成針對(duì)SARS-CoV-2N基因的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物和探針。所有引物及探針序列和PCR擴(kuò)增片段大小，見表1。1.4表達(dá)載體pACYC-MS2的構(gòu)建以合成質(zhì)粒pBSK-MS2作為模板擴(kuò)增噬菌體MS2編碼成熟酶和外殼蛋白基因的片段。PCR反應(yīng)條件為：95。。5min；94°C30s、62°C30s、72°C150s，33個(gè)循環(huán)；72C10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后，經(jīng)BamHI/NotI雙酶切消化，克隆于pACYCDuet-1多克隆位點(diǎn)1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC-MS2，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序進(jìn)行鑒定。1.5雙表達(dá)載體pACYC-MS2-CoV-2N的構(gòu)建以合成質(zhì)粒pBSK-CoV-2N作為模板，擴(kuò)增含有SARS-CoV-2完整N基因的序列，并通過在上下游引物添加C-突變體pac位點(diǎn)序列，將其加入N基因的首末端。PCR反應(yīng)條件為：95C5min；94C30s、61C30s、72C90s，35個(gè)循環(huán)；72C10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后，經(jīng)FseI/PacI雙酶切，克隆于pACYCDuet-1多克隆位點(diǎn)2,構(gòu)建出重組質(zhì)粒pACYC-MS2-CoV-2N，并經(jīng)測(cè)序進(jìn)行鑒定。1.6裝甲R(shí)NA顆粒的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將重組質(zhì)粒pACYC-MS2-CoV-2N轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在氯霉素抗性的LB中37C、200r/min轉(zhuǎn)速搖床上振蕩培養(yǎng)，在OD6OOnm值約為0.6h，加IPTG至終濃度1mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，3h后離心收集菌體并重懸于裂解緩沖液（50mmol/LTris，pH8.0，5mmol/LMgSO4，0.1mmol/LNaCl）中進(jìn)行超聲裂解，然后離心收集上清液，加入終濃度為50U/pL和10U/pL的RNaseA和DNaseI，37C作用40min去除大腸桿菌核酸。最后，使用SephacrylS-200層析柱對(duì)裝甲R(shí)NA顆粒進(jìn)行純化，保存于4C。1.7裝甲R(shí)NA顆粒的鑒定為驗(yàn)證制備的裝甲R(shí)NA是否含有全長(zhǎng)SARS-CoV-2N基因，將裝甲R(shí)NA顆粒使用磁珠法提取總核酸，再使用引物CoV-2-NR42C反轉(zhuǎn)錄1h。對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的核酸以及未提取核酸的RNA顆粒按照1.5條件進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并將目的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pGEM-T載體后進(jìn)行測(cè)序鑒定。1.8裝甲R(shí)NA顆粒耐核酸酶試驗(yàn)將制備的裝甲R(shí)NA顆粒和從裝甲顆粒中提取的核酸，分別使用核糖核酸酶A（5U/pL）和DNA酶I（0.1U/pL）37C消化60min。消化后，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。1.9裝甲R(shí)NA顆粒的定量1.9.1體外轉(zhuǎn)錄RNA（IVT-RNA）外標(biāo)準(zhǔn)品的制備表1基因克隆和鑒定用引物和探針Table1Primersandprobeforgenecloningandidentification基因名稱 引物名稱和序列（5'-3'） 擴(kuò)增長(zhǎng)度（bp）MS2-F:TCGGGATCCTGGCTATCGCTGTAGGTAGCC(BamHI)MS2 1682MS2-R:GGTAAGCGGCCGCTGGCCGGCGTCTATTAGTAG(NotI)CoV-2-NF:TTAGGCCGGCCACATGAGGATCACCCATGTATGTCTGATAATGGACCCCAAAATC(FseI)SARS-CoV-2N 1321CoV-2-NR:GCCTTAATTAAACATGGGTGATCCTCATGTATTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACT(PacI)COV2-RF:GGGGAACTTCTCCTGCTAGAATSARS-CoV-2NCOV2-RR:CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 99(熒光RT-PCR)COV2-RP:[FAM]-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-[BHQ1]將提純的pBSK-CoV-2N質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶表1基因克隆和鑒定用引物和探針Table1Primersandprobeforgenecloningandidentification基因名稱 引物名稱和序列（5'-3'） 擴(kuò)增長(zhǎng)度（bp）MS2-F:TCGGGATCCTGGCTATCGCTGTAGGTAGCC(BamHI)MS2 1682MS2-R:GGTAAGCGGCCGCTGGCCGGCGTCTATTAGTAG(NotI)CoV-2-NF:TTAGGCCGGCCACATGAGGATCACCCATGTATGTCTGATAATGGACCCCAAAATC(FseI)SARS-CoV-2N 1321CoV-2-NR:GCCTTAATTAAACATGGGTGATCCTCATGTATTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCACT(PacI)COV2-RF:GGGGAACTTCTCCTGCTAGAATSARS-CoV-2NCOV2-RR:CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 99(熒光RT-PCR)COV2-RP:[FAM]-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-[BHQ1]1.9.2裝甲R(shí)NA顆粒質(zhì)控品的定量采用針對(duì)SARS-CoV-2N基因的熒光RT-PCR方法，對(duì)制備的已知濃度的IVT-RNA和裝甲R(shí)NA顆粒提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)線性回歸，獲得回歸方程，通過公式計(jì)算出裝甲R(shí)NA核酸拷貝數(shù)。依據(jù)計(jì)算結(jié)果，用Hank's液將對(duì)裝甲R(shí)NA病毒樣顆粒進(jìn)行稀釋，混勻后分裝入凍存管中，每支1mL，置于-80^保存。1.10均勻性檢驗(yàn)隨機(jī)抽取10管制備的裝甲R(shí)NA顆粒質(zhì)控品，提取RNA，使用針對(duì)SARS-CoV-2N基因的熒光RT-PCR方法在一次試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。1.11穩(wěn)定性檢驗(yàn)隨機(jī)抽取制備的裝甲rna顆粒質(zhì)控品，分別在室溫37。。，冷藏溫度2?8°C,-20。。及-80。。保存（對(duì)照），每隔7d取樣置于-80C。6個(gè)月后使用針對(duì)SARS-CoV-2N基因的熒光RT-PCR方法進(jìn)行外標(biāo)法拷貝數(shù)定量檢測(cè)，分析裝甲rna顆粒的穩(wěn)定性。2結(jié)果2.1裝甲R(shí)NA顆粒pACYC-MS2的構(gòu)建PCR擴(kuò)增MS2噬菌體編碼成熟酶和外殼蛋白基因片段，定向克隆于pACYCDuet-1多克隆位點(diǎn)1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC-MS2,重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序進(jìn)行鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增片段約為1.7kb，與預(yù)期大小相符，見圖1。測(cè)序結(jié)果顯示編碼成熟酶和外殼蛋白基因片段正確克隆到載體pACYCDuet-1中。1M21M22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp1682bpM:DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:陰性對(duì)照；2:MS2基因PCR擴(kuò)增片段圖1MS2噬菌體基因擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1AmplificationofMS2phagegene2.2雙表達(dá)載體pACYC-MS2-CoV-2N的構(gòu)建PCR擴(kuò)增出得到SARS-CoV-2完整N基因，并通過在上下游引物添加C-突變pac位點(diǎn)序列，將其加入N基因的首末端。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約1.3kb，與預(yù)期目的片段大小相符，見圖2。將擴(kuò)增基因目的片段定向克隆于pACYC-MS2的多克隆位點(diǎn)2中，獲得重組質(zhì)粒pACYC-MS2-CoV-2N,測(cè)序結(jié)果表明SARS-CoV-2完整N基因正確克隆到載體中。1M21M22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp1321bpM:DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:陰性對(duì)照；2:SARS-CoV-2N基因PCR擴(kuò)增片段圖2SARS-CoV-2完整N基因PCR擴(kuò)增Fig.2AmplificationofcompleteNgeneofSARS-CoV-22.3裝甲R(shí)NA顆粒的表達(dá)純化及鑒定將載體pACYC-MS2-CoV-2N轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得表達(dá)重組菌。

裂解菌體，并使用較高濃度RNaseA和DNaseI充分去除其中的大腸桿菌核酸。然后使用SephacrylS-200層析柱對(duì)裝甲R(shí)NA顆粒進(jìn)行純化，獲得含SARS-CoV-2完整N基因的裝甲R(shí)NA顆粒。使用引物CoV-2-NR對(duì)提取的核酸42。。反轉(zhuǎn)錄后，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的核酸以及未提取核酸的RNA顆粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，僅反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶，見圖3。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，表明所制備的裝甲R(shí)NA顆粒包裹了目的RNA片段，且沒有殘存的DNA。2.4病毒樣顆粒耐核酸酶試驗(yàn)將裝甲R(shí)NA顆粒和從其中提取的核酸經(jīng)核酸酶消化后，提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，裝甲R(shí)NA顆粒處理前后提取的核酸檢測(cè)結(jié)果的Ct值無顯著差異，而提取的RNA經(jīng)處理后檢測(cè)為無擴(kuò)增曲線，表明制備的裝甲R(shí)NA顆粒能夠抵抗2種核酸酶的作用。2.5裝甲R(shí)NA顆粒作為核酸檢測(cè)質(zhì)控品的制備用10倍系列稀釋的IVT-RNA溶液(10?106copies/pL)作為外標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)，1321bp—1321bp—2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp1 2M34 5M:DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1,2:裝甲R(shí)NA顆粒提取核酸的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；3:陰性對(duì)照；4:裝甲R(shí)NA顆粒提取核酸未反轉(zhuǎn)錄直接擴(kuò)增結(jié)果；5:裝甲R(shí)NA顆粒直接擴(kuò)增結(jié)果圖3含SARS-CoV-2完整N基因的裝甲R(shí)NA顆粒PCR鑒定結(jié)果

Fig.3PCRidentificationofarmoredRNAparticlescontaining

SARS-CoV-2completeNgene1,900,0001,800,0001,700,0001,600,0001,500,0001,400,0001,300,0001,200,0001,100,000C1,000,000腭900,000800,000700,000600,000500,000400,000300,000200,000100,000-100,000AmplificationPlot262830圖4熒光RT-PCR對(duì)系列稀釋IVT-RNA(10-106copies/pL)的檢測(cè)結(jié)果Fig.4Testingresultofreal-timeRT-PCRforserialdilutedIVT-RNA(10T06copies/pL)將Ct值與濃度對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸，獲得方程y=-3.427x+36.479,R=0.999,PCR擴(kuò)增效率為95.802%，見圖41,900,0001,800,0001,700,0001,600,0001,500,0001,400,0001,300,0001,200,0001,100,000C1,000,000腭900,000800,000700,000600,000500,000400,000300,000200,000100,000-100,000AmplificationPlot262830圖4熒光RT-PCR對(duì)系列稀釋IVT-RNA(10-106copies/pL)的檢測(cè)結(jié)果Fig.4Testingresultofreal-timeRT-PCRforserialdilutedIVT-RNA(10T06copies/pL)StandardCurve37.535.032.530.027.5o25.°22.520.017.515.012.5■NT.rqwttNStandardCurve37.535.032.530.027.5o25.°22.520.017.515.012.5■NT.rqwttNSlope:-3.427V-Intert36.479R2；0.999 95.802Errors0.0280.10.2 12345102030 100200 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000Quantity圖5熒光RT-PCR對(duì)IVT-RNA檢測(cè)結(jié)果的線性回歸萬程Fig.5Regressionofreal-timeRT-PCRresultsforIVT-RNA按照每支1mL分裝保存于-80^ocopies/mL之間。以上結(jié)果表明制備的裝甲R(shí)NA2.6均勻性檢驗(yàn)對(duì)隨機(jī)抽取的質(zhì)控品，在一次試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)。采用單因子方差分析對(duì)Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.32%，小于5%，表明樣品中病毒樣顆粒分布較為均勻。2.7穩(wěn)定性檢驗(yàn)隨機(jī)抽取制備的質(zhì)控品，分別在室溫37。。，冷藏溫度2?8。。，-20。及-80。保存（對(duì)照），每隔7d取樣置于-80。。°6個(gè)月后應(yīng)用針對(duì)N基因的SARS-CoV-2熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，分析裝甲R(shí)NA顆粒的穩(wěn)定性°結(jié)果顯示，裝甲R(shí)NA顆粒在冷藏溫度2?8。。，-20。。保存6個(gè)月與-80。。保存條件下相比，濃度無顯著變化。在37。。條件下可穩(wěn)定保存12周（84d）,見圖6°其核酸濃度定量結(jié)果在0.95X106?1.06x106質(zhì)控品穩(wěn)定性好。1.5x10圖6裝甲R(shí)NA質(zhì)控品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Fig.6StabilitytestingofarmoredRNAqualitycontrols3討論MS2噬菌體包含約3.6kb的RNA基因組，編碼4個(gè)蛋白，即成熟酶、衣殼蛋白、裂解蛋白和復(fù)制酶。衣殼蛋白和成熟酶為噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白，衣殼由180個(gè)14kD的衣殼蛋白分子組成，成熟酶可保護(hù)RNA基因組免于核酸酶降解，同時(shí)也是噬菌體侵染大腸桿菌的受體結(jié)合蛋白。利用MS2噬菌體主要結(jié)構(gòu)蛋白可制備含有靶向外源RNA的非感染性重組類病毒顆粒（VLP），具有抗核酸酶、穩(wěn)定、非感染性、可定量等優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)RNA病毒最合適的陽性質(zhì)控品，已經(jīng)在診斷試劑外標(biāo)品方面得到廣泛應(yīng)用［7"10］o生產(chǎn)裝甲R(shí)NA的首選策略是通過MS2的自組裝機(jī)制將外源RNA包裝到MS2外殼蛋白中。MS2自組裝機(jī)制是由外殼蛋白和位于復(fù)制酶基因5'端的19個(gè)堿基的單莖環(huán)結(jié)構(gòu)（pac位點(diǎn)）之間的高度特異性相互作用啟動(dòng)的。理論上，MS2至少可包裝1900bp的外源RNA，然而，當(dāng)外源RNA大小超過500bp時(shí)，包裝效率迅速降低［5-6］。研究表明，pac位點(diǎn)在裝甲R(shí)NA的包裝中起著極其重要的作用。已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)pac位點(diǎn)-5位置處的尿嘧啶被胞嘧啶（C突變體）取代后，pac位點(diǎn)與外殼蛋白之間的親和力會(huì)顯著增加，此外，增加pac位點(diǎn)的數(shù)量也可以提高外殼蛋白和外源RNA之間的親和力。通過增加pac位點(diǎn)的親和力（用C-突變體p