金屬硫蛋白對仔豬抗氧化功能及SOD基因表達的影響

金屬硫蛋白對仔豬抗氧化功能及SOD基因表達的影響李麗立，劉云華，侯德興，印遇龍，張彬，侯振平，邱細敏【關鍵詞】金屬硫蛋白；抗氧化酶；基因表達；仔豬【Abstrat】AI:TinverstigatetheeffetsfexgenusZnetallthinEin(ZnT)nantixidativefuntinandgeneexpressinfSDineaningpiglets.ETHDS:Eighteenpiglets(Dur×Landrae×Yrkshire)ereseletedanddividedint3grups(1,2and3)randly.Thepigletseresprttprduestress.ZnTfpigletliverdisslvedinphysilgialsalineeretheninjetedintthepigletsfgrup1,2and3iththenentratinsf0,0.8,1.6g/kg,respetively.Threeand6hlater,3pigletsereseletedfreahgruprandlyandslaughteredtgetliversaples.ThebiheialindexesrelatedtantixidatinandthelevelfSDgeneexpressininlivereredeterined.RESULTS:AfterZnTinjetin,theativitiesfSDandGSHPXinreasedsignifiantly(P0.05)，thententfDAdereasedsignifiantly(P0.05),andthelevelfantireativexygenspeiesandantisuperxideaninhadthetrendfiprveent.SixhursafterZnTinjetin,thelevelfSDgeneexpressiningrup2and3inreasedsignifiantlyasparediththatingrup1(P0.05).ThelevelfSDgeneexpressiningrup2and3at6henhanedsignifiantlyasparediththatat3h.Thus,urdataindiatedthatZnTtreatentstiulatedSDRNAexpressininatieanddsedependentanner.NLUSIN:AtivityfantixidaseanbeinreasedbysuppleentfZnT,therebyiprvingtheperfantistress.【Keyrds】etallthinein;antixidativeenzye;geneexpressin;piglet【摘要】目的：用仔豬作模型，研究經(jīng)鋅元素誘導的外源性金屬硫蛋白〔ZnT〕對機體抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SD)基因表達的影響.方法：選用杜長大雜交仔豬18頭，隨機分為3組(1,2和3〕.分別肌肉注射經(jīng)生理鹽水溶解的豬肝ZnT0g/kg(1組〕，0.8g/kg〔2組〕,1.6g/kg〔3組〕，讓仔豬運動產(chǎn)生應激.注射T后3h和6h，分別從每組取3頭仔豬屠宰取肝臟，測定肝臟中與抗氧化有關的生化指標，檢測肝臟SD基因表達程度.結果：在應激條件下，補充外源性ZnT一段時間后，仔豬肝臟SD，GSHPX活性顯著升高(P0.05)，DA含量顯著降低(P0.05)，肝臟抗活性氧和抗超氧陰離子程度也有進步的趨勢.在注射ZnT后6h，0.8g/kg，1.6g/kg組仔豬肝臟SD基因表達程度比對照組顯著進步(P0.05).0.8g/kg組和1.6g/kg組6hSD基因表達程度比3h顯著增加，說明T對SD基因表達的誘導與時間和劑量關系親密.結論：補充外源性ZnT可進步應激機體的抗氧化物酶活性，從而進步機體的抗應激才能.【關鍵詞】金屬硫蛋白；抗氧化酶；基因表達；仔豬0引言應激可使機體脂質(zhì)過氧化反響增強，繼而通過產(chǎn)生自由基造成組織損傷,致生物體病變，消費力下降，甚至死亡［1］.金屬硫蛋白〔etallthinein,T〕是分子量低、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白.研究說明，T具有顯著的去除自由基、抗脂質(zhì)過氧化和增強機體免疫力的作用［2-3］.因此，T通過去除自由基，可增強抗氧化酶的活性，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈式反響，減少膜脂質(zhì)過氧化損傷，減少DNA損傷.因此將T應用于動物，完全有可能到達緩解氧化應激，進步生長速度，減少疾病的發(fā)生，減緩鮮肉氧化速度，延長動物利用年限，進步經(jīng)濟效益的目的.但以往有關金屬硫蛋白的抗氧化、抗應激研究以內(nèi)源性為主，而且大都僅從抗氧化酶的活性變化來討論金屬硫蛋白去除自由基、抗氧化的作用.有關T在豬體內(nèi)的研究鮮見報道.基于此，我們以杜長大雜交仔豬為對象，通過注射外源性ZnT，測定肝臟與自由基有關的生化指標以及肝臟中SD基因表達程度，從蛋白和基因程度討論外源性ZnT在應激狀態(tài)下對抗氧化酶的影響.1材料和方法1.1材料選用胎次、日齡一樣并且體質(zhì)量相近的杜長大三元雜交雄性仔豬18頭，14d一次性斷奶，單欄飼養(yǎng)，自由采食和飲水.試驗前體質(zhì)量〔4.42±0.24〕kg.屠宰前1d停食，不斷水.梯度PR儀：德國Eppendrf消費，型號為5331055888；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠消費，型號為DYY6B；凝膠成像系統(tǒng)：美國UVPBilagingSyste消費，型號為GDS8000；紫外分析儀：北京六一儀器廠消費，型號為D9403B；紫外分光光度計：德國Eppendrf消費，型號為603105430；超低溫冰箱：青島海爾股份消費，型號為BD396LT65；臺式離心機：德國Eppendrf消費，型號為entrifuge5415D；低溫離心機：德國Eppendrf消費，型號為entrifuge5810R；微波爐：青島海爾股份消費，型號為HR6702D.豬肝ZnT：本課題組提取的產(chǎn)品；BIXYTEHSD525T試劑盒：購自XIS公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX)活力測定試劑盒、丙二醛(DA)測定試劑盒、活性氧(RS)測定試劑盒、超氧陰離子(SA)自由基測定試劑盒：購自南京建成生物工程研究所；ISGEN總RNA抽提試劑盒：購自日本基因株式會社；RTPR試劑：購自AershaPharaiaBiteh公司；瓊脂糖及Tris：購自Rhe公司；GeneRulerT100bpDNALadder：購自BIFerntas公司.1.2方法1.2.1試驗設計將18頭供試仔豬，隨機分為3組，每組6頭.驅(qū)趕仔豬使其產(chǎn)生應激，然后3組分別肌肉注射經(jīng)生理鹽水溶解的豬肝ZnT0g/kg〔1組〕，0.8g/kg〔2組〕,1.6g/kg〔3組〕.在注射T后3h和6h，分別從每組隨機抽取3頭仔豬，從前腔靜脈放血屠宰，取肝臟，測定肝臟中與抗氧化有關的生化指標，檢測肝臟SD基因表達程度.1.2.2樣品采集解剖時取兩份1g左右的肝臟迅速用無菌錫鉑紙包好并編號于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱中以備總RNA的抽提和肝臟上清液的制備.1.2.3肝臟上清液的制備取0.2g左右經(jīng)低溫保存的肝組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱質(zhì)量，放入玻璃勻漿管中，然后用移液管量取預冷的生理鹽水(8.6g/L)，生理鹽水的體積是組織塊質(zhì)量的9倍.將勻漿管下端插入盛有冰水混合物的器皿中，上下轉(zhuǎn)動搗桿數(shù)10次，充分研碎，使組織勻漿化.將制備好的100L/L的勻漿在4℃，3000r/in離心15in，取上清液.1.2.4肝臟中與抗氧化有關的生化指標的測定肝臟上清液中SD活性,GSHPX,DA,RS和SA自由基程度的測定按各試劑盒說明書操作.1.2.5基因表達分析采用半定量RTPR方法，以3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)標［4］.1.2.5.1總RNA的提取采用ISGENLS總RNA抽提試劑盒，按說明書操作，提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計測得A260/A280在1.8~2.0之間，可作為逆轉(zhuǎn)錄反響的模板.1.2.5.2引物設計根據(jù)網(wǎng)上(.nbi.nl.nih.gv/)發(fā)表的基因序列〔SD：E06791，GAPDH：AF017079〕采用引物設計軟件進展設計，SD上游引物：5′ATTATGGGAGAAGG3′,下游引物：5′TAATTAAAAGGA3′,擴增長度453bp；內(nèi)標GAPDH上游引物5′TGAAGGATTTGGGAT3′,下游引物5′TTTATGGTGTGAAGA3′,擴增長度297bp；引物均由日本株式會社DNA合成事業(yè)部合成.1.2.5.3RTPR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反響(RTPR)用ReadtGRTPRbeads試劑采用一步法進展.1.2.5.4RTPR產(chǎn)物定量取15μLPR擴增產(chǎn)物于20g/L瓊脂糖凝膠上電泳〔含溴化乙錠〕，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果并拍照.采用圖像處理系統(tǒng)對PR產(chǎn)物條帶進展密度掃描，以3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為RTPR的質(zhì)控，將待測SD基因表達與其對應GAPDH表達的比值進展比擬后得出一相對量，從而計算出各組的基因表達量的相對變化量.統(tǒng)計學處理：計量數(shù)據(jù)以x±s表示.采用SAS6.12統(tǒng)計軟件進展方差分析(GL過程)，并用Dunan法進展多重比擬.2結果2.1T對仔豬肝臟抗氧化才能的影響仔豬應激時注射外源性ZnT一段時間后，仔豬肝臟SD，GSHPX活性升高，DA含量降低，抗活性氧和抗超氧陰離子程度也有進步的趨勢.尤其在注射ZnT后6h，肝臟SD，GSHPX活性，DA含量各組比擬差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05，表1).同時由表1知，注射一樣劑量ZnT，6hSD，GSHPX活性比3h進步，且Ⅲ組6hSD，GSHPX活性比3h進步(P0.05)，DA含量降低(P0.01).各組肝臟抗活性氧和抗超氧陰離子程度6h與3h相比也有進步的趨勢.表1不同劑量的T對仔豬肝臟中與抗氧化有關的指標的影響2.2T對仔豬肝臟SD基因表達程度的影響由表2和圖1,2可知，注射T后3h各組相比，肝臟SD基因表達程度差異不顯著(P0.05).注射T后6h各組相比，Ⅲ組肝臟SD基因表達程度比Ⅰ組顯著進步(P0.05).注射一樣劑量ZnT在不同的時間，第1組3h與6h肝臟中SD基因表達程度相比差異不顯著(P0.05).第2組和第3組6h肝臟中SD基因表達程度比其3h的顯著進步(P0.05).表2不同劑量的T對仔豬肝臟中SD基因表達程度的影響3討論正常情況下，機體存在一個完好的包含酶系和非酶系的抗氧化系統(tǒng)，抗氧化酶有SD，GSHPX等，非酶系有VE、復原性谷胱甘肽等，均有去除自由基的作用.在他們的協(xié)同作用下，使體內(nèi)過多的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的水，起到抗氧化的作用.羥自由基是最活潑，也是毒性較大的含氧自由基.由于至今體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)羥自由基的去除酶系，T有效地抗羥自由基作用顯得重要.Adel等［5］比擬了T與谷胱甘肽抗羥自由基保護DNA的作用，發(fā)現(xiàn)當T濃度為13μl/L時，DNA的降解幾乎完全被抑制，而10l/L的GSH才能到達此作用.而且在某些應激情況下，GSH程度下降，而T合成增加.本試驗結果說明，注射外源ZnT后，在一定的時間和濃度下，可顯著進步仔豬肝臟SD，GSHPX的活性，降低肝中DA的含量.肝臟抗活性氧和抗超氧陰離子的程度也有進步的趨勢,從而進步機體的抗應激才能.本結果同時說明，仔豬應激時，外源性補充ZnT一段時間后，SDRNA表達程度進步，SD的活性增加.Sugin等［6］研究小鼠的黃酮細胞發(fā)現(xiàn)SD活性還受精胺的調(diào)控，這種調(diào)控是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄程度.ZnT中半胱氨酸含量豐富，在巰基化合物生成的同時，并有精氨酸殘基，這樣提供了SD活性增強的物質(zhì)根底.【參考文獻】［1］祁克宗.內(nèi)毒素性微循環(huán)山羊氧自由基代謝的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，1999,32(3):90-95.［2］ZhuZB.EffetfZn7etallthinEinnxidativestressinliverfratsithseveretheralinjury［J］.AtaPharalSin，2022,24(8):764-760.［3］鄭軍恒，李海洋，茹剛，等.金屬硫蛋白去除羥自由基的研究［J］.北京大學學報:自然科學版，1999,35(2):573-576.［4］HuDX,Fukuda,Fujii,etal.Transriptinalregulatinfnitinaideadeninedinuletidephsphate:quinnexidredutaseinurinehepataellsby6(ethylsufinyl)hexylisthiyanate,anativepriniplefasabi(Eutreaasabiaxi.)［J］.anerLett,2000,161:195-200.［5］AdelJ,deRuiterN.Inhibitinfhydr