色譜法的理論與實(shí)踐課件

色譜法的理論與實(shí)踐11/23/20221色譜法的理論與實(shí)踐11/22/20221一、色譜基礎(chǔ)理論概述色譜法或稱層析法（chromatography）是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。1906年俄國植物學(xué)家TswettM將碳酸鈣裝在豎立的玻璃柱內(nèi)，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗，在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜法。11/23/20222一、色譜基礎(chǔ)理論概述色譜法或稱層析法（chromatogra色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復(fù)使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達(dá)到分離。色譜技術(shù)在近二十多年中的飛速發(fā)展已形成一門專門的科學(xué)，稱為色譜學(xué)。廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。11/23/20223色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異二、色譜法的分類

按流動(dòng)相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類按流動(dòng)相的分子聚集狀態(tài)分類GC，LC，超臨界流體色譜（SFC）按固定相的聚集狀態(tài)分類氣相色譜法（氣-固，氣-液）液相色譜法（液-固，液-液）按操作形式分類柱色譜，平面色譜，逆流分配11/23/20224二、色譜法的分類按按色譜過程的分離機(jī)制分類

吸附色譜（adsorption~）利用吸附能力的差別.分配色譜（partition~）利用分配系數(shù)的差別.空間（分子）排阻色譜（stericexclusion~）或稱凝膠色譜法（gel~）利用被測物分子大小不同而導(dǎo)致的滲透系數(shù)差異.11/23/20225按色譜過程的分離機(jī)制分類吸附色譜（adsorption~離子交換色譜（ionexchange~）利用在離子交換樹脂上的交換能力差別。又可分為:氨基酸分析（aminoacidanalysis）離子色譜法（ionchromatography）親合色譜（affinity~）將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進(jìn)行分離(專用于蛋白質(zhì)等生化樣品）。11/23/20226離子交換色譜（ionexchange~）11/22/20毛細(xì)管電色譜（capillaryelectro-~）依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數(shù)和電泳速度差別而分離。毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis）以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品組分的淌度和分配系數(shù)而分離。手性色譜（chiralchromatography）利用手性識別原理，用于手性藥物的分離分析。11/23/20227毛細(xì)管電色譜（capillaryelectro-~）11填充柱毛細(xì)管柱毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電泳柱色譜平面色譜逆流分配色譜GC

LCSFCCEC色譜法經(jīng)典液相色譜HPLC紙色譜法薄層色譜法薄膜色譜法11/23/20228填充柱毛細(xì)管電色譜柱色譜GC色譜法經(jīng)典液相色譜紙色譜法11/熱力學(xué)理論——塔片理論是由平衡的觀點(diǎn)來研究分離過程，是一種半經(jīng)驗(yàn)理論，以塔片理論為代表。動(dòng)力學(xué)理論——速率理論是從動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)，即速度來研究各種動(dòng)力學(xué)因素對柱效的影響，以VanDeemeter方程式為代表。三、色譜理論

11/23/20229熱力學(xué)理論——塔片理論三、色譜理論11/22/20基本概念色譜峰（peak）——樣品產(chǎn)生的電信號強(qiáng)度對洗脫時(shí)間作圖。稱為流出曲線，濃度-時(shí)間曲線，也稱色譜帶（band）。色譜峰有三種形式：對稱峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）11/23/202210基本概念11/22/202210峰形參數(shù)：對稱因子（symmetryfactor，fs）fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）來衡量T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)掌握11/23/202211峰形參數(shù)：掌握11/22/202211T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的對稱性hABd1xW0.05h11/23/202212W0.05h=x=h/20峰的對稱性hA一個(gè)色譜峰，可用三項(xiàng)參數(shù)來描述：峰高或峰面積——定量峰位（保留值）——定性峰寬——衡量柱效峰面積(A)峰高(h)tRtR掌握11/23/202213一個(gè)色譜峰，可用三項(xiàng)參數(shù)來描述：峰面積(A)峰高(h)t基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流動(dòng)相通過時(shí)的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時(shí)間的變化。噪音（noise，N）——各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。Nmv基線漂移掌握11/23/202214基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流定性參數(shù)保留值保留時(shí)間，保留體積相對保留值保留指數(shù)11/23/202215定性參數(shù)11/22/202215保留值保留時(shí)間（retentiontime，tR）——進(jìn)樣開始到組分色譜峰頂點(diǎn)時(shí)間間隔。死時(shí)間（deadtime，t0或tM）——流動(dòng)相通過色譜系統(tǒng)的時(shí)間。11/23/202216保留值11/22/202216調(diào)整保留時(shí)間（adjustedretentiontime，t’R）也稱為表觀保留時(shí)間、校正保留時(shí)間——某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時(shí)間，即：t’R=tR－t0，在實(shí)驗(yàn)條件一定（溫度、固定相），t’R決定組分的性質(zhì)，故t’R是定性的基本參數(shù)。11/23/202217調(diào)整保留時(shí)間（adjustedretentiontimet’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進(jìn)樣11/23/202218t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進(jìn)保留體積（retentionvolume，VR），又稱洗脫體積——流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，由進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)，通過色譜柱的流動(dòng)相體積。

11/23/202219保留體積（retentionvolume，VR），又稱相對保留值（1,2)——指組分（1）與參照物（2）兩者調(diào)整保留值的比值。1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K為分配系數(shù)）保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)）——是把組分的保留行為換算成相當(dāng)于含有幾個(gè)碳的正構(gòu)烷烴的保留行為來描述。11/23/202220相對保留值（1,2)保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)）11/柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋?biāo)準(zhǔn)差（，standarddeviation)半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基線寬度（peakwidth，W或Y）熟悉11/23/202221柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋┦煜?1/22/202221標(biāo)準(zhǔn)差——在正態(tài)分布曲線中，將x=±1處（拐點(diǎn)）的峰寬之半稱為標(biāo)準(zhǔn)偏差。在實(shí)際工作中,標(biāo)準(zhǔn)差為峰高0.607h處的峰寬之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607hxx=0時(shí)，曲線的高度為峰高h(yuǎn)11/23/202222標(biāo)準(zhǔn)差——在正態(tài)分布曲線中，將x=±1處（拐點(diǎn)）的峰寬之半稱半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355，W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。h0.5hW1/211/23/202223半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。對色譜峰兩側(cè)作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以：W=4W11/23/202224峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線,在極限上所截

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355，W=4=1.699W1/211/23/202225Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2分配系數(shù)（partitioncoefficient，K）

在一定條件下，達(dá)到分配平衡后：樣品組分在固定相中的濃度（Cs）樣品組分在流動(dòng)相中的濃度（Cm）K=Cs/Cm

=K11/23/202226分配系數(shù)（partitioncoefficient，K）分離參數(shù)分離參數(shù)用于衡量分離條件的優(yōu)劣，常用分離度，表示。分離度（resolution，R）R=即相鄰兩峰分開的距離是平均峰寬[(W1+W2)/2]的幾倍。R大,分離效果好。2（tR2-tR1）W1+W211/23/202227分離參數(shù)2（tR2-tR1）W1+W211/22/20R=0.5tR2-tR1=2，稱為2分離。分離后各峰露出的面積≥68.3%R=1.0稱為4（峰頂間距為4），兩峰峰基略有重疊，裸露峰面積≥95.4%R=1.5tR2-tR1=6，稱為6分離（峰頂間距為6），分離后各峰露出的面積≥99.7%R﹥1.5R﹥1.5，稱為完全分離11/23/202228R=0.5tR2-tR1=2，稱為2分離。分離后各峰露出塔板理論把色譜柱看作一個(gè)分餾塔，在每個(gè)塔板的間隔內(nèi)，樣品混合物在氣液兩相中達(dá)到分配平衡，經(jīng)多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分，先到達(dá)塔頂（先流出色譜柱）。由于色譜柱的塔板相當(dāng)多，因此分配系數(shù)的微小差別就可獲得很好的分離效果。在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)（相當(dāng)于一個(gè)分餾塔），組分可以很快在兩相間達(dá)到平衡，H稱為理論塔板高度。11/23/202229塔板理論11/22/202229理論板數(shù)（n）與理論板高度（H）

n=（tR/）2n=5.54（tR/w1/2）2n=16(tR/w)2n越大，柱效越高。如果用t’R計(jì)算理論板數(shù)，所得值為有效理論板數(shù)n有效11/23/202230理論板數(shù)（n）與理論板高度（H）11/22/202230理論板數(shù)取決于：固定相種類、性質(zhì)、填充狀況、柱長；流動(dòng)相及其流速；被測物性質(zhì)等。理論板高(H)H=L/nL為色譜柱長度，當(dāng)L一定時(shí)，H與n呈反比，即H越小，柱效越高。11/23/202231理論板數(shù)取決于：11/22/202231速率理論速率理論是把色譜過程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對峰展寬的影響。氣相色譜——VanDeemeter方程式HPLC速率方程式——Giddings方程式11/23/202232速率理論11/22/202232重點(diǎn)：1.色譜理論2.色譜分類方法3.主要術(shù)語概念：11/23/202233重點(diǎn)：11/22/202233色譜法的理論與實(shí)踐11/23/202234色譜法的理論與實(shí)踐11/22/20221一、色譜基礎(chǔ)理論概述色譜法或稱層析法（chromatography）是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法。1906年俄國植物學(xué)家TswettM將碳酸鈣裝在豎立的玻璃柱內(nèi)，從頂端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚沖洗，在柱的不同部位形成色帶，因而命名為色譜法。11/23/202235一、色譜基礎(chǔ)理論概述色譜法或稱層析法（chromatogra色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異，通過多次重復(fù)使微小的差別積累起來變成大的差異，從而使混合物中各組分達(dá)到分離。色譜技術(shù)在近二十多年中的飛速發(fā)展已形成一門專門的科學(xué)，稱為色譜學(xué)。廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，成為多組分混合物的最重要的分離分析方法。11/23/202236色譜法是利用物質(zhì)在不同的兩相中分配、吸附或其他親和作用的差異二、色譜法的分類

按流動(dòng)相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類按流動(dòng)相的分子聚集狀態(tài)分類GC，LC，超臨界流體色譜（SFC）按固定相的聚集狀態(tài)分類氣相色譜法（氣-固，氣-液）液相色譜法（液-固，液-液）按操作形式分類柱色譜，平面色譜，逆流分配11/23/202237二、色譜法的分類按按色譜過程的分離機(jī)制分類

吸附色譜（adsorption~）利用吸附能力的差別.分配色譜（partition~）利用分配系數(shù)的差別.空間（分子）排阻色譜（stericexclusion~）或稱凝膠色譜法（gel~）利用被測物分子大小不同而導(dǎo)致的滲透系數(shù)差異.11/23/202238按色譜過程的分離機(jī)制分類吸附色譜（adsorption~離子交換色譜（ionexchange~）利用在離子交換樹脂上的交換能力差別。又可分為:氨基酸分析（aminoacidanalysis）離子色譜法（ionchromatography）親合色譜（affinity~）將生物活性配位基（酶、輔酶，抗體等）鍵合到載體表面形成固定相，利用親合力大小進(jìn)行分離(專用于蛋白質(zhì)等生化樣品）。11/23/202239離子交換色譜（ionexchange~）11/22/20毛細(xì)管電色譜（capillaryelectro-~）依靠色譜與電場兩種作用力，利用分配系數(shù)和電泳速度差別而分離。毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis）以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)樣品組分的淌度和分配系數(shù)而分離。手性色譜（chiralchromatography）利用手性識別原理，用于手性藥物的分離分析。11/23/202240毛細(xì)管電色譜（capillaryelectro-~）11填充柱毛細(xì)管柱毛細(xì)管電色譜毛細(xì)管電泳柱色譜平面色譜逆流分配色譜GC

LCSFCCEC色譜法經(jīng)典液相色譜HPLC紙色譜法薄層色譜法薄膜色譜法11/23/202241填充柱毛細(xì)管電色譜柱色譜GC色譜法經(jīng)典液相色譜紙色譜法11/熱力學(xué)理論——塔片理論是由平衡的觀點(diǎn)來研究分離過程，是一種半經(jīng)驗(yàn)理論，以塔片理論為代表。動(dòng)力學(xué)理論——速率理論是從動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)，即速度來研究各種動(dòng)力學(xué)因素對柱效的影響，以VanDeemeter方程式為代表。三、色譜理論

11/23/202242熱力學(xué)理論——塔片理論三、色譜理論11/22/20基本概念色譜峰（peak）——樣品產(chǎn)生的電信號強(qiáng)度對洗脫時(shí)間作圖。稱為流出曲線，濃度-時(shí)間曲線，也稱色譜帶（band）。色譜峰有三種形式：對稱峰拖尾峰（tailingpeak）前延峰（leadingpeak）11/23/202243基本概念11/22/202210峰形參數(shù)：對稱因子（symmetryfactor，fs）fs=(A+B)/2A；或用：拖尾因子（tailingfactor，T）來衡量T=W0.05h/2d1T=0.95～1.05(正常峰)T＜0.95(前延峰)T﹥1.05(拖尾峰)掌握11/23/202244峰形參數(shù)：掌握11/22/202211T=W0.05h/2d1，或fs=(A+B)/2AW0.05h=x=h/20峰的對稱性hABd1xW0.05h11/23/202245W0.05h=x=h/20峰的對稱性hA一個(gè)色譜峰，可用三項(xiàng)參數(shù)來描述：峰高或峰面積——定量峰位（保留值）——定性峰寬——衡量柱效峰面積(A)峰高(h)tRtR掌握11/23/202246一個(gè)色譜峰，可用三項(xiàng)參數(shù)來描述：峰面積(A)峰高(h)t基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流動(dòng)相通過時(shí)的流出曲線稱為基線。它反映了儀器的噪音隨時(shí)間的變化。噪音（noise，N）——各種未知的偶然因素引起的基線起伏的現(xiàn)象稱為噪音。噪音的大小用噪音帶的寬度來描述。Nmv基線漂移掌握11/23/202247基線（baseline）——在操作條件下，檢測器中只有流定性參數(shù)保留值保留時(shí)間，保留體積相對保留值保留指數(shù)11/23/202248定性參數(shù)11/22/202215保留值保留時(shí)間（retentiontime，tR）——進(jìn)樣開始到組分色譜峰頂點(diǎn)時(shí)間間隔。死時(shí)間（deadtime，t0或tM）——流動(dòng)相通過色譜系統(tǒng)的時(shí)間。11/23/202249保留值11/22/202216調(diào)整保留時(shí)間（adjustedretentiontime，t’R）也稱為表觀保留時(shí)間、校正保留時(shí)間——某組分由于溶解或被吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的組分在柱中多停留的時(shí)間，即：t’R=tR－t0，在實(shí)驗(yàn)條件一定（溫度、固定相），t’R決定組分的性質(zhì)，故t’R是定性的基本參數(shù)。11/23/202250調(diào)整保留時(shí)間（adjustedretentiontimet’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進(jìn)樣11/23/202251t’R1t’R3t’R2t0tR3tR2tR1mvtime進(jìn)保留體積（retentionvolume，VR），又稱洗脫體積——流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，由進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)，通過色譜柱的流動(dòng)相體積。

11/23/202252保留體積（retentionvolume，VR），又稱相對保留值（1,2)——指組分（1）與參照物（2）兩者調(diào)整保留值的比值。1,2=t’R（1）/

t’R（2）

=K1/K2(K為分配系數(shù)）保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)）——是把組分的保留行為換算成相當(dāng)于含有幾個(gè)碳的正構(gòu)烷烴的保留行為來描述。11/23/202253相對保留值（1,2)保留指數(shù)（I，Kovats指數(shù)）11/柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋?biāo)準(zhǔn)差（，standarddeviation)半峰寬（peakwidthathalf-height，W1/2或Y1/2）基線寬度（peakwidth，W或Y）熟悉11/23/202254柱效率的參數(shù)（色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋┦煜?1/22/202221標(biāo)準(zhǔn)差——在正態(tài)分布曲線中，將x=±1處（拐點(diǎn)）的峰寬之半稱為標(biāo)準(zhǔn)偏差。在實(shí)際工作中,標(biāo)準(zhǔn)差為峰高0.607h處的峰寬之半。峰形窄，小，分散度小，柱效高。反之，柱效低。h0.607hxx=0時(shí)，曲線的高度為峰高h(yuǎn)11/23/202255標(biāo)準(zhǔn)差——在正態(tài)分布曲線中，將x=±1處（拐點(diǎn)）的峰寬之半稱半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.355，W1/2易確定，且比值大，故測量誤差較小。h0.5hW1/211/23/202256半峰寬——也稱半腰寬，為色譜峰高之半處的峰寬。W1/2=2.峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線,在極限上所截的距離,稱為峰寬。對色譜峰兩側(cè)作切線后為等腰三角形，底邊為峰寬，而為等腰三角形高度之半處的寬度之半，所以：W=4W11/23/202257峰寬——也稱基線寬度。對色譜峰兩側(cè)的拐點(diǎn)作切線,在極限上所截

Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2.355，W=4=1.699W1/211/23/202258Wh0.5h0.607hW1/2W1/2=2分配系數(shù)（partitioncoefficient，K）

在一定條件下，達(dá)到分配平衡后：樣品組分在固定相中的濃度（Cs）樣品組分在流動(dòng)相中的濃度（Cm）K=Cs/Cm

=K11/23/202259分配系數(shù)（partitioncoefficient，K）分離參數(shù)分離參數(shù)用于衡量分離條件的優(yōu)劣，常用分離度，