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文檔簡介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR1Outline實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床和科研上的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)例Outline實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理2實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理3常規(guī)vs實(shí)時(shí)常規(guī)PCR:借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù):利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最終精確的對(duì)起始模板的定量分析MJResearch常規(guī)vs實(shí)時(shí)常規(guī)PCR:借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量4常規(guī)vs實(shí)時(shí)優(yōu)缺點(diǎn)比較優(yōu)勢(shì)來自:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物濃度實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實(shí)時(shí)分析每一次循環(huán)產(chǎn)物凝膠電泳分析終產(chǎn)物精確計(jì)算初始模板濃度,靈敏度高,檢測(cè)單拷貝模板通過終產(chǎn)物定性分析模板濃度計(jì)算機(jī)自動(dòng)紀(jì)錄分析檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力常規(guī)vs實(shí)時(shí)優(yōu)缺點(diǎn)比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實(shí)時(shí)分5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期實(shí)時(shí)熒光PCR熒光曲線圖循環(huán)數(shù),熒光值指數(shù)擴(kuò)增期數(shù)學(xué)規(guī)律非指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增產(chǎn)物熒光曲線背景期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期實(shí)時(shí)熒光PCR熒光曲線圖非指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增產(chǎn)6PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng):Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXnn:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0:初始模板量Ex:擴(kuò)增效率PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)7閾值與C(t)值閾值(Xn):熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))C(t)值(n):熒光信號(hào)(擴(kuò)增產(chǎn)物)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04閾值與C(t)值閾值(Xn):熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個(gè)8PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng):Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達(dá)到C(t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得: logX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)初始濃度的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0:初始模板量Ex:擴(kuò)增效率PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)9C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定;C(t)值具重現(xiàn)性C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)910熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多,C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)11定量原理濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量定量原理濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值12熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)熒光化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物濃度熒光監(jiān)測(cè)方法分類非特異性SYBRGreenI特異性MolecularBeaconTaqMan熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)熒光化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物濃度13SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束,形成雙鏈DNA,SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中,當(dāng)受到適合光源激發(fā),發(fā)射出熒光,反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點(diǎn)使用方便,無需復(fù)雜的設(shè)計(jì)無序列特異性,可用于不同模板便宜,靈敏缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝14MolecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu),與特異產(chǎn)物配對(duì)熒光素,淬滅劑FRET(熒光諧振能量傳遞)優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性低背景缺點(diǎn)設(shè)計(jì)復(fù)雜只能用于一個(gè)特定目標(biāo)價(jià)格較高M(jìn)olecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu),與特異產(chǎn)物配對(duì)15TaqMan水解型熒光素,淬滅劑FRET(熒光諧振能量傳遞)識(shí)別特異性產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列特異性高設(shè)計(jì)相對(duì)MolecularBeacon簡單缺點(diǎn)只適用于一個(gè)目標(biāo)價(jià)格較高探針5‘端不能是G(切下后淬滅)TaqMan水解型16熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)方式總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號(hào)檢測(cè)主要應(yīng)用范圍SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸熔解曲線分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復(fù)性SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因TaqMan水解型雜交探針(5‘-3’外切)有任何步驟SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)方式總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號(hào)檢測(cè)主要應(yīng)17小結(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR各種熒光監(jiān)測(cè)方法的原理實(shí)時(shí)熒光數(shù)據(jù)結(jié)果的初步分析C(t)值線性關(guān)系小結(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR18實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量19絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量:精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度(DNA,RNA)病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量:計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量差異表達(dá)分析芯片評(píng)估轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)基因型檢測(cè)絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量:精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度(D20實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板,按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t),構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)曲線unknown1021SYBRGreenI方法SYBRGreenI方法22反應(yīng)體系的建立按照常規(guī)PCR方法配制反應(yīng)體系,并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End問題:PCR的不特異性產(chǎn)物;SYBRGreenI的非特異結(jié)合解決:熔鏈曲線分析,決定讀板溫度Meltingcurveanalysis反應(yīng)體系的建立按照常規(guī)PCR方法配制反應(yīng)體系,并加入SYBR23熔鏈曲線分析逐步提高溫度,讀取熒光值,得到溫度與熒光值的關(guān)系曲線溫度熒光強(qiáng)度TmTm值:DNA解鏈一半時(shí)的溫度-dIdTTm熔鏈曲線分析逐步提高溫度,讀取熒光值,得到溫度與熒光值的關(guān)系24熔鏈曲線分析決定讀板溫度Non-specificproductspecificproductspecificproduct熔鏈曲線分析決定讀板溫度Non-specificprodu25優(yōu)化的程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.85c1sec7.ReadPlate8.Goto2repeat399.72c5min10.Meltingcurveanalysis11.End優(yōu)化的程序1.95c5min26使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)敏感性高檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品:單拷貝區(qū)分小差異樣品:24,48,96,……大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測(cè)100—1010省時(shí)有效使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)敏感性高27實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量相對(duì)定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異(倍數(shù)關(guān)系)相對(duì)定量的問題解決樣品材料不均一造成的差別解決加樣過程中的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定,受環(huán)境因素影響較小對(duì)目的基因進(jìn)行均一化:目的基因拷貝/每一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因拷貝實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量相對(duì)定量的目的28實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR29Outline實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床和科研上的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)例Outline實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理30實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本原理31常規(guī)vs實(shí)時(shí)常規(guī)PCR:借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù):利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最終精確的對(duì)起始模板的定量分析MJResearch常規(guī)vs實(shí)時(shí)常規(guī)PCR:借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量32常規(guī)vs實(shí)時(shí)優(yōu)缺點(diǎn)比較優(yōu)勢(shì)來自:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物濃度實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實(shí)時(shí)分析每一次循環(huán)產(chǎn)物凝膠電泳分析終產(chǎn)物精確計(jì)算初始模板濃度,靈敏度高,檢測(cè)單拷貝模板通過終產(chǎn)物定性分析模板濃度計(jì)算機(jī)自動(dòng)紀(jì)錄分析檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力常規(guī)vs實(shí)時(shí)優(yōu)缺點(diǎn)比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實(shí)時(shí)分33實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期實(shí)時(shí)熒光PCR熒光曲線圖循環(huán)數(shù),熒光值指數(shù)擴(kuò)增期數(shù)學(xué)規(guī)律非指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增產(chǎn)物熒光曲線背景期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指數(shù)擴(kuò)增期實(shí)時(shí)熒光PCR熒光曲線圖非指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增產(chǎn)34PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng):Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXnn:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0:初始模板量Ex:擴(kuò)增效率PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)35閾值與C(t)值閾值(Xn):熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))C(t)值(n):熒光信號(hào)(擴(kuò)增產(chǎn)物)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04閾值與C(t)值閾值(Xn):熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個(gè)36PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng):Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:

logXn=log(X0(1+Ex)n) 整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達(dá)到C(t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得: logX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)初始濃度的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0:初始模板量Ex:擴(kuò)增效率PCR的數(shù)學(xué)知識(shí)理想的PCR反應(yīng):n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)37C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定;C(t)值具重現(xiàn)性C(t)值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)938熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多,C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)39定量原理濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量定量原理濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值40熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)熒光化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物濃度熒光監(jiān)測(cè)方法分類非特異性SYBRGreenI特異性MolecularBeaconTaqMan熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)熒光化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物濃度41SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束,形成雙鏈DNA,SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中,當(dāng)受到適合光源激發(fā),發(fā)射出熒光,反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點(diǎn)使用方便,無需復(fù)雜的設(shè)計(jì)無序列特異性,可用于不同模板便宜,靈敏缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果SYBRGreenI結(jié)合雙鏈DNA分子小溝42MolecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu),與特異產(chǎn)物配對(duì)熒光素,淬滅劑FRET(熒光諧振能量傳遞)優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性低背景缺點(diǎn)設(shè)計(jì)復(fù)雜只能用于一個(gè)特定目標(biāo)價(jià)格較高M(jìn)olecularBeacon頸環(huán)結(jié)構(gòu),與特異產(chǎn)物配對(duì)43TaqMan水解型熒光素,淬滅劑FRET(熒光諧振能量傳遞)識(shí)別特異性產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列特異性高設(shè)計(jì)相對(duì)MolecularBeacon簡單缺點(diǎn)只適用于一個(gè)目標(biāo)價(jià)格較高探針5‘端不能是G(切下后淬滅)TaqMan水解型44熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)方式總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號(hào)檢測(cè)主要應(yīng)用范圍SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸熔解曲線分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復(fù)性SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因TaqMan水解型雜交探針(5‘-3’外切)有任何步驟SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因熒光化學(xué)監(jiān)測(cè)方式總結(jié)化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號(hào)檢測(cè)主要應(yīng)45小結(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR各種熒光監(jiān)測(cè)方法的原理實(shí)時(shí)熒光數(shù)據(jù)結(jié)果的初步分析C(t)值線性關(guān)系小結(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR46實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量47絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量:精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度(DNA,RNA)病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量:計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量差異表達(dá)分析芯片評(píng)估轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)基因型檢測(cè)絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量:精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度(D48實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板,按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t),構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)曲線unknown1049SYBRGreenI方法SYBRGreenI方法50反應(yīng)體系的建立按照常規(guī)PCR方法配制反應(yīng)體系,并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End問題:PCR的不特異性產(chǎn)物;SYBRGree

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