淀粉酶溫氏測定法

關(guān)于淘汰血、尿淀粉酶溫氏測定法淘汰血、尿淀粉酶（AMS）溫氏測定法的理由及替代方法淘汰的理由淀粉酶是一類能將淀粉分子水解的酶。人類的淀粉酶屬于。淀粉酶，或稱內(nèi)切淀粉酶，有任意.切割a-1,4糖苷鍵的能力，作用于多糖后可產(chǎn)生葡聚糖、麥芽糖和葡萄糖分子。測定淀粉酶的方法很多，有粘度法，濁度法，糖化法，淀粉——碘量法，染料釋放法等。前二者由于影響因素較多，缺乏特異性和靈敏度，巳被淘汰。糖化法雖然可直接測量酶活性，但操作復(fù)雜不適用于臨床常規(guī)檢查。目前應(yīng)用較為廣泛的為碘量法，酶速率法和染料釋放法等。溫氏法是基于碘量法原理的一種半定量方法。做為一種測定淀粉酶活性的方法，目前認為最好具備下述幾個條件，即：應(yīng)用性質(zhì)穩(wěn)定的限定性底物；有好的限定性反應(yīng)產(chǎn)物；在30°C反應(yīng)時有足夠的靈敏度；沒有內(nèi)源性葡萄糖干擾等。從這些條件來看，溫氏法是不符舍要求的。它以測定剩余底物反映酶活性，對淀粉的要求沒有限定性規(guī)格，用生理鹽水稀釋而非緩沖液亦不符合酶學(xué)測定要求，肉眼觀察顏色來判斷結(jié)果，只能屬于半定量方法，不能準確與精確的反映酶活性。此法不敏感，淀粉酶升高的陽性率低於酶法和染料衫，易給臨床造成誤診。因此，在有許多更為靈敏且特異方法的情況下，溫氏法巳失去其實用價值。可替代的方法目前應(yīng)用的有碘淀粉比色法，酶法與染料釋放法等。后二聿試劑配制困難，但巳有商品試劑盒供應(yīng)?，F(xiàn)將此三種方法介紹于下。一、碘淀粉比色法（一）原理血清（或血漿）中a-粉酶催化淀粉分子中。a-1，4葡萄糖苷鏈水解，產(chǎn)生葡萄糖，麥芽糖及含。a-1，6糖苷鍵支鏈的糊精。在巳知底物濃度的條件下，反應(yīng)后加入的碘液與未被水解而剩余的淀粉結(jié)合成藍色復(fù)合物。其藍色灼深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的對照管比較，即可推算出淀粉酶的活力單位。（二）試劑1、4g/L緩沖淀粉溶液于約500ml蒸餾水中，溶解9g氯化鈉，22.6g無水磷酸氫二鈉（或56.94gNa2HPO4。12H2O）和12.5g無水磷酸二氫鉀。加熱至沸。另取一小燒杯，精確稱取0.4g可溶性淀粉，加入約10ml蒸餾水，使溶液成糊狀后，加入上述沸騰之溶液中，水洗燒杯一并倒入。冷至室溫后，加如37C甲醛溶液5ml，用蒸餾水稀釋至1L。此溶液pH為7.0±0.1，應(yīng)置冰箱保存。2.0.1mol/L碘貯存液于約400ml蒸餾水中溶解1.7835g碘酸鉀（KIO3）及22.5g碘化鉀（K1），緩慢加入4.5ml濃鹽酸，邊加邊攪拌，用蒸餾水稀釋到500ml，充分混勻，貯淙色瓶，置冰箱保存。3、0.01mol/L碘應(yīng)用液取碘貯存液，用蒸餾水稀釋10倍，貯棕色瓶，置冰箱可用一個月。（三）操作血清先用生理鹽水作10倍稀釋后，按表1操作。表1碘淀粉比色法測定淀粉酶操作步驟測定管（M）對照管（B）緩沖淀粉溶液（ml）（37C預(yù)溫5分鐘）1.01.0稀釋血清（ml）0.2混均，置37C水溶中準7.5分鐘碘應(yīng)用液（ml）1.01.0蒸餾水（ml）6.06.2混勻，于600nm波長處，用10mm光徑比色杯比色，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。單位定義：100mi血清中的淀粉酶在37°C15分鐘水解5mg淀粉為1個單位。計算：淀粉酶單位=s-■-■''■-a參考值：血清80—180單位，尿液100—1200單位。（四）附注1、草酸鹽、枸椽酸鹽、EDTANa:及氟化鈉對AMS活性有抑制，肝素?zé)o抑制。2、酶活性在400單位以下時與底物的水解量成線性。如測定管吸光度小于空白管吸光度一半時，應(yīng)將稀釋血清再行稀釋，測定結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。3、本法亦適用于其它體液淀粉酶的測定。尿液先作20倍稀釋后測定，其參考位為100—1200單位。4、唾液含高濃度淀粉酶，須防止污染。5、淀粉溶液若出現(xiàn)混濁或絮狀物，表示淀粉溶液受污染或變質(zhì)，不能再用。二、酶速率法本類方法中有以合成色素原做底物的方法，也有用輔酶一脫氨酶做指示系統(tǒng)的紫外監(jiān)測法。操作方法均應(yīng)按試劑盒說明進行。現(xiàn)以某一試劑盒為例，做一介紹。（一）原理P-硝基苯麥芽三格昔+3HQ里鮑Ep-硝基苯酚+所形成硝基苯酚在405nm波長有最大吸收。硝基苯酚形成的速率與血清（或尿液）中淀粉酶的活性成正比。測定405nm波長下吸光度增加的速率，即可測出淀粉酶的活力。（二）試劑名稱主要成分實驗濃度試劑I（RI）（片劑）a-葡糖苷酶>30g/mlP-硝基苯麥芽庚糖苷5mmol/L試劑II(RII)磷酸緩沖液100mmol/L、pH7.1NaCl50mmol/L工作液將一片RI放入2mlRlI中，適用前預(yù)熱到測試的溫度使其完全溶解，即為工作也。試劑復(fù)溶前在2—8°C保存，可穩(wěn)定至標(biāo)簽上注明的日期。復(fù)溶后在2—8°C，可穩(wěn)定2天。在15—25°C可穩(wěn)定8小時。（三）操作樣品可用血清、肝素抗凝血漿或尿液（表2）表2酶速率法測定淀粉酶操作步驟工作液2.00ml血清或血漿0.05ml尿液0.02ml混合均勻后，倒入比色杯。在37C保溫3分鐘，讀取初始吸光度，同時開始計時。在精確計時的1、2、3分鐘時，分別讀取吸光度。確定每分鐘的平均吸光度變化（^A/分鐘），并用它進行計算。計算：血清、血漿AMS（M/L）=11604AA405nm/分鐘尿液AMS（M/L）=28585XAA405nm/分鐘P-硝基苯酚毫克分子消光系數(shù)=1.17772.05TOC\o"1-5"\h\z血清因數(shù)計算=X1000.02x1.1777x32.02尿因數(shù)計算=x1000.02x1.1777x3當(dāng)分析24小時尿液時，利用以上公式，并將結(jié)果乘以在24小時內(nèi)收集的尿液的體積。如用ZS-1型半自動生化分析儀，可用下列參數(shù)進行：樣品量15gl試劑量600ml反應(yīng)溫度37C波長405nm延遲時間180秒測量時間20秒計算因數(shù)28585參考值37C血清，血漿V220U/L隨意尿V1200U/L24小時尿液<1100U/24h（四）注意事項1、如果在3分鐘測量時間內(nèi)，吸光度變化小分鐘超過0.150,則用1.0ml?0.9%NaC1溶解稀釋0.1ml樣品，再重新測定，結(jié)果乘以11。2、如果測定不能在405nm波長下進行，則必須使用P一硝基苯酚校正溶液制定標(biāo)準曲線。3、血紅蛋白濃度高達250mg/100ml（0.124mmol/L）時不影響測定。4、試劑II中含疊氮鈉作為穩(wěn)定劑，應(yīng)避免與皮膚或粘膜接觸。5、底物反應(yīng)釋放出來硝基苯酚有毒，不要吸入其蒸汽并避免與皮膚接觸。如果溶液與皮膚接觸，立即用聚乙二醇400或用大量水沖一洗。6、如果使用自動生化儀進行測定，可根據(jù)以上提供的樣品與試劑之比，及延遲時間、線性時間這三個基本參數(shù)，按照所使用儀器的程序要求編制具體實驗條件。7、本試驗亦可在25°C與35°C下進行，但需加大樣品量，改變計算參數(shù)。三、染料法有不同種類的染料與結(jié)合底物。染料試劑片多由商品提供，應(yīng)按試劑盒操作說明進行試驗。現(xiàn)以某商品試劑為例加以介紹。（一）原理此試驗為半合成底物法。即將天然淀粉經(jīng)過1.4-Butanedioldiepoxide鍵合形成不溶性淀粉，再與蘭色色素（CibachrorBlueF3GA）結(jié)合形成蘭色淀粉聚合物。在a-淀粉酶作用下，底物中1，4糖苷鍵被切斷，脫落下可溶性的小分子蘭色淀粉聚合物，因而溶液的蘭色深淺與淀粉酶活性相關(guān)，可用以求出a-淀粉酶活性。（二）試劑1、淀粉色素片2、酶標(biāo)準液3、0.5NNaOH（三）操作1、樣品（血液或尿液）操作（表3）表3染料釋放法測定淀粉酶的操作步驟血清測定管尿液測定管空白管血清31）100尿液31）50蒸餾水444淀粉試劑片111旋轉(zhuǎn)振蕩10秒鐘，使試劑片充分溶解。在15分鐘37C水浴中，血液孵育30分鐘，尿液1。0.5NNaOH(ml)1113500rpm/分離心5分鐘，取上清在620nm處，以空白調(diào)零，讀取吸光度，即可從標(biāo)準曲線上查得結(jié)果。尿液結(jié)果需乘以4求得。2.標(biāo)準曲線制作法（表4）表4?標(biāo)準曲線制作試管號123456空白酸原液（ul）1020501002004000蒸餾水（ml）4444444.1試劑片1111111同血清操作液量修正系數(shù)5.01/5.15.02/5.15.05/5.15.1/5.15.2/5.15.4/5.11相應(yīng)酶活性**應(yīng)由酶原液或定性質(zhì)控血清計算求得以吸光度為縱坐標(biāo)，酶活性單位為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準曲線。（四）附注試劑片不可用手觸模。如顯色溶液吸光度值過高，可用蒸餾水稀釋后比色，再乘以稀釋倍數(shù)。脂血混濁或高膽紅素血清應(yīng)做樣品空白。于樣品空白試管中加100町0.5NNaOH即可。溶血血紅蛋白在50